孙红霞
- 作品数：3 被引量：4H指数：1
- 供职机构：武汉市医学科学研究所更多>>
- 发文基金：湖北省自然科学基金国家自然科学基金武汉市卫生局科研项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- APPβ分泌酶切割位点特异性单链抗体的制备和鉴定被引量：3
- 2012年
- 目的制备针对人淀粉样蛋白前体(APP)β分泌酶切割位点的特异性单链抗体(ScFv),并进行鉴定。方法设计扩增单克隆抗体细胞株重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗人APPβ分泌酶切割位点单克隆抗体细胞株中扩增出VH和VL基因片段,然后通过重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成ScFv基因片段,再将其亚克隆入原核表达载体pET-28a中,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,目的蛋白经镍柱纯化和复性后,用SDS-PAGE、ELISA和Western blot等方法对其检测分析。结果成功从一株抗人APPβ位点单克隆抗体细胞株2H10中扩增出VH和VL并拼接成ScFv片段,片段长744 bp,编码248个氨基酸。PCR、酶切和测序表明表达载体构建成功,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导可以表达出约29 ku的目的蛋白,主要为包涵体形式,经镍柱纯化和复性后,获得纯度达90%以上的ScFv蛋白,ELISA和Western blot检测表明可溶性ScFv可以与人APPβ分泌酶切割位点序列短肽和全长APP结合。结论成功构建并表达人APPβ分泌酶切割位点的特异性单链抗体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。
- 黄巍周丽荣周婷孙红霞黄晓刚刘桥
- 关键词：Β分泌酶单链抗体阿尔采末病Β淀粉样蛋白
- 淀粉样前体蛋白β位点单链抗体抑制β淀粉样肽的分泌被引量：1
- 2015年
- 目的观察淀粉样前体蛋白(APP)β位点单链抗体(sc Fv)对APP的α和β代谢的影响,为其作为APPβ分泌酶特异抑制剂奠定基础。方法以APPβ位点sc Fv 2H10基因序列为模板,通过PCR引入Igκ轻链信号序列和myc标签,与真核表达载体pc DNA3.1hyg(^+)相连,转染过表达人瑞典突变型淀粉样前体蛋白695(APP695)的CHO细胞株(APP695sw/CHO),经潮霉素B筛选出稳定转染细胞株,用夹心ELISA检测稳定转染细胞株培养上清中Aβ40和分泌型APPα(s APPα)的含量,并分别比较两者的变化。结果经PCR、酶切和测序鉴定证明,获得引入Igκ分泌信号和myc标签的APPβ位点sc Fv基因片段,且与真核表达载体正确相连。转染APP695sw/CHO细胞后,经潮霉素B筛选得到稳定转染株;Western blot法可检测到目的蛋白表达,ELISA结果显示,与对照相比,稳定转染细胞培养上清Aβ40分泌量约下降30.4%、s APPα水平上升23.1%。结论 APPβ位点sc Fv在抑制Aβ分泌的同时还可能有利于APP的α代谢,可作为β分泌酶高特异性抑制剂。
- 黄巍周丽荣李小鸥孙红霞周婷黄晓刚刘桥
- 关键词：淀粉样前体蛋白单链抗体Β淀粉样肽
- 野生型和突变型APP695稳定转染CHO分泌Aβ40和Aβ42的比较被引量：1
- 2013年
- 目的:建立野生型和瑞典突变型淀粉样蛋白前体695(APP695)稳定转染CHO细胞株,比较两者分泌Aβ40和Aβ42的能力,为筛选β分泌酶抑制剂奠定基础。方法:以人淀粉样蛋白前体751(APP751)基因序列为模板,通过突变分别获得野生型APP695wt和瑞典突变型APP695sw序列,再连入真核表达载体pcDNA3.1,转染CHO细胞并经G418筛选出稳转细胞株,通过ELISA法检测培养上清中Aβ40和Aβ42的含量,然后检测APPβ位点抗体对Aβ分泌的影响。结果:获得了APP695wt和APP695sw序列,构建载体并稳定转染的CHO细胞株,可检测到两种目的蛋白均有表达,相对分子质量约为98kDa。ELISA法只能检测到APP695sw稳转细胞有高水平Aβ40和Aβ42产生,Aβ40的分泌量约是Aβ42的24.57倍,可达约14000pg/ml。APPβ位点抗体可降低Aβ分泌量,但不影响Aβ40/Aβ42的比值。结论:成功获得APP695wt和APP695sw稳定转染细胞株,其中后者高分泌Aβ40和A42,适用于β分泌酶抑制剂的筛选。
- 黄巍周丽荣李小鸥孙红霞周婷黄晓刚刘桥
- 关键词：稳定转染
