周丽荣
- 作品数：10 被引量：9H指数：2
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- 淀粉样前体蛋白β位点单链抗体抑制β淀粉样肽的分泌被引量：1
- 2015年
- 目的观察淀粉样前体蛋白(APP)β位点单链抗体(sc Fv)对APP的α和β代谢的影响,为其作为APPβ分泌酶特异抑制剂奠定基础。方法以APPβ位点sc Fv 2H10基因序列为模板,通过PCR引入Igκ轻链信号序列和myc标签,与真核表达载体pc DNA3.1hyg(^+)相连,转染过表达人瑞典突变型淀粉样前体蛋白695(APP695)的CHO细胞株(APP695sw/CHO),经潮霉素B筛选出稳定转染细胞株,用夹心ELISA检测稳定转染细胞株培养上清中Aβ40和分泌型APPα(s APPα)的含量,并分别比较两者的变化。结果经PCR、酶切和测序鉴定证明,获得引入Igκ分泌信号和myc标签的APPβ位点sc Fv基因片段,且与真核表达载体正确相连。转染APP695sw/CHO细胞后,经潮霉素B筛选得到稳定转染株;Western blot法可检测到目的蛋白表达,ELISA结果显示,与对照相比,稳定转染细胞培养上清Aβ40分泌量约下降30.4%、s APPα水平上升23.1%。结论 APPβ位点sc Fv在抑制Aβ分泌的同时还可能有利于APP的α代谢,可作为β分泌酶高特异性抑制剂。
- 黄巍周丽荣李小鸥孙红霞周婷黄晓刚刘桥
- 关键词：淀粉样前体蛋白单链抗体Β淀粉样肽
- 靶向沉默ADAM10基因对心肌细胞N-cadherin加工的影响被引量：3
- 2012年
- 目的:研究心肌细胞中解整合素金属蛋白酶家族(ADAMs)成员ADAM10在神经型钙黏蛋白(N-cadherin)底物加工过程中的重要性,为探求该加工途径在维持心肌组织结构形态和完整性中的作用打下基础。方法:将质粒sc-270165 ADAM10 siRNA(r)转染入大鼠心肌细胞(H9c2),建立ADAM10稳定沉默的心肌细胞株。通过Western blotting检测心肌细胞N-cadherin及其C末端片段(CTF)的蛋白表达,流式细胞术检测心肌细胞表面N-cadherin的表达。利用黏附实验检测其对细胞黏附能力的影响。结果:与阴性对照组相比,ADAM10基因沉默组心肌细胞N-cadherin蛋白表达提高,CTF蛋白表达减少;细胞表面N-cadherin的表达增多,心肌细胞黏附能力提高。结论:心肌细胞中ADAM10在N-cadherin的加工水解过程中可能发挥了作用。
- 李小鸥黄巍陈亚隽周丽荣
- 关键词：ADAM10细胞黏附
- APPβ分泌酶切割位点特异性单链抗体的制备和鉴定被引量：3
- 2012年
- 目的制备针对人淀粉样蛋白前体(APP)β分泌酶切割位点的特异性单链抗体(ScFv),并进行鉴定。方法设计扩增单克隆抗体细胞株重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗人APPβ分泌酶切割位点单克隆抗体细胞株中扩增出VH和VL基因片段,然后通过重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成ScFv基因片段,再将其亚克隆入原核表达载体pET-28a中,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,目的蛋白经镍柱纯化和复性后,用SDS-PAGE、ELISA和Western blot等方法对其检测分析。结果成功从一株抗人APPβ位点单克隆抗体细胞株2H10中扩增出VH和VL并拼接成ScFv片段,片段长744 bp,编码248个氨基酸。PCR、酶切和测序表明表达载体构建成功,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导可以表达出约29 ku的目的蛋白,主要为包涵体形式,经镍柱纯化和复性后,获得纯度达90%以上的ScFv蛋白,ELISA和Western blot检测表明可溶性ScFv可以与人APPβ分泌酶切割位点序列短肽和全长APP结合。结论成功构建并表达人APPβ分泌酶切割位点的特异性单链抗体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。
- 黄巍周丽荣周婷孙红霞黄晓刚刘桥
- 关键词：Β分泌酶单链抗体阿尔采末病Β淀粉样蛋白
- 白藜芦醇通过SIRT1激活ADAM10促进APPα代谢
- 2022年
- 目的:探讨白藜芦醇可否通过SIRT1激活解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)促进APPα代谢抑制Aβ分泌。方法:选取过表达人瑞典突变淀粉样前体蛋白APP695sw的细胞模型,分别设立DMSO空白对照组、SIRT1激活剂白藜芦醇组和SIRT1抑制剂EX527组。给药后,ELISA法分别检测细胞培养上清中sAPPα和Aβ的含量,免疫印记Western Blot法检测细胞SIRT1和ADAM10的蛋白水平。结果:与对照组比较,白藜芦醇组细胞培养上清sAPPα的含量增高,Aβ含量下降,sAPPα/Aβ比值增大,细胞SIRT1和ADAM10蛋白水平增高;而抑制剂EX527组与对照相比,细胞培养上清sAPPα的含量降低,Aβ含量升高,sAPPα/Aβ比值减小,细胞SIRT1和ADAM10蛋白水平降低;抑制剂下调SIRT1后各项指标与激动剂组呈现相反的趋势(P<0.05)。结论:白藜芦醇可通过SIRT1激活ADAM10,促进APP进行α非淀粉样代谢途径,增强sAPPα分泌并抑制Aβ产生。
- 黄巍周曦周丽荣卢坤
- 关键词：白藜芦醇ADAM10淀粉样前体蛋白Β淀粉样肽
- 解整合素金属蛋白酶10基因慢病毒载体的构建及鉴定
- 2013年
- 目的:构建解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒载体,为进一步体内外实验研究提供基础。方法:筛选确定ADAM10基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与LentiLox3.7载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用重组慢病毒转导传代心肌细胞(H9C2),通过Western blotting检测心肌细胞ADAM10的蛋白表达。结果:获得的载体插入ADAM10的shRNA核苷酸链序列正确,包装的慢病毒颗粒转导心肌细胞,与对照组比较ADAM10 shRNA转染成功抑制ADAM10蛋白表达。结论:成功构建AD-AM10 shRNA慢病毒载体,为其在扩张型心肌病(DCM)中的生物学功能研究奠定基础。
- 李小鸥黄巍何兵周丽荣
- 关键词：RNA干扰慢病毒扩张型心脏病
- 封闭N-cadherin解整合素金属蛋白酶水解位点的单链抗体的制备及鉴定被引量：1
- 2013年
- 目的制备封闭神经型钙黏素(N-cadherin)解整合素金属蛋白酶水解位点(ADAM)的单链抗体(scFv),并进行鉴定。方法首先利用RT-PCR技术从分泌抗N-cadherin的ADAM水解位点单克隆抗体(mAb)细胞株中扩增出重链(V_H)和轻链(V_L)可变区基因片段,然后通过重叠延伸PCR法(SOE-PCR),构建成scFv基因片段。再将其克隆入原核表达载体pET-28a中,在大肠杆菌中诱导表达,通过镍柱纯化和复性后,用SDS-PAGE、ELISA和Western blot法等测定重组蛋白的生物学活性。结果PER、酶切和测序表明scFv片段长744 bp,编码248个氨基酸。scFv基因表达载体转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达出相对分子质量(M_r)约29 000的目的蛋白,主要为包涵体形式,经变性,纯化和复性后,获得纯度达90%以上的scFv蛋白,ELISA和Western blot法检测表明可溶性scFv可以与N-cadherin的ADAM水解位点序列多抗原短肽和全长N-cadherin结合。结论成功构建并表达封闭N-cadherin的ADAM加工位点单链抗体。
- 李小鸥黄巍李莉周丽荣
- 关键词：ADAM10N-CADHERIN单链抗体基因表达
- ADAM10真核表达载体的构建及其对MCF-7增殖迁移的影响被引量：1
- 2012年
- 目的构建ADAM10真核表达载体,观察稳定转染乳腺癌细胞MCF-7后对其增殖和迁移的影响。方法利用PCR技术扩增人ADAM10的基因片段,克隆入pcDNA3.1真核表达载体,阳性克隆通过PCR、酶切和测序鉴定。脂质体法将重组质粒转染MCF-7细胞,通过G418筛选出稳定转染ADAM10的细胞株,通过Western blot检测细胞ADAM10的表达,通过MTT法和Transwell法分别检测细胞的增殖和迁移变化。结果经PCR、酶切和测序鉴定证明ADAM10真核表达载体构建成功,Western blot结果显示稳定转染细胞的ADAM10蛋白高表达,MTT实验显示转染细胞增殖速度稍快于对照(P<0.05),Transwell结果显示转染细胞迁移能力比对照强(P<0.01)。结论成功构建ADAM10真核表达载体,稳定转染MCF-7细胞后可增强细胞的增殖和迁移,为进一步研究ADAM10生物学作用奠定基础。
- 黄巍李小鸥周丽荣黄晓刚刘桥
- 关键词：MCF-7细胞细胞迁移
- 在DH5α中拼接构建ADAM10全长真核表达载体的基因突变
- 2012年
- 目的:构建ADAM10真核表达载体,为进一步研究其生物学功能打基础。方法:将人ADAM10的上下两部分基因片段(分别为全长基因的1～910bp和911～2 247bp片段),依次与真核表达载体pcDNA3.1相连,以大肠杆菌DH5α或BL21(DE3)作为感受态宿主菌用于转化连接产物,拼接成全长的阳性克隆通过PCR、酶切和测序鉴定。结果:ADAM10下段基因与已正确连入上段的pcDNA3.1重组质粒拼接时,若用DH5α为感受态菌,则下半段出现碱基插入增加512bp,测序结果显示为ADAM10基因第1 531 bp～2 042 bp间的序列有紧邻的双份;若用BL21(DE3)为感受态,则无突变。结论:将ADAM10基因与pcDNA3.1真核表达载体依次拼接构建重组质粒时,以DH5α为宿主菌可出现基因序列增加的罕见突变,而以BL21(DE3)为宿主则无突变,由此成功构建ADAM10全长基因与pcDNA3.1的重组质粒。
- 黄巍李小鸥周丽荣黄晓刚刘桥
- 关键词：ADAM真核表达载体
- ADAM10基因RNA干扰重组慢病毒的转导对H9C2细胞N型钙粘蛋白的解整合素金属蛋白酶10加工途径的影响被引量：1
- 2013年
- 目的构建ADAM10基因RNA干扰重组慢病毒，观察其在N型钙粘蛋白底物加工过程中的重要性，为探求该加工途径在维持心肌组织结构形态和完整性中的作用打下基础。方法筛选确定ADAM10基因RNA干扰有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，与LentiLox3．7载体连接，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。用重组慢病毒转导心肌细胞（H9C2），通过Westernblotting检测心肌细胞N型钙粘蛋白及其C-端的CTFl片段的蛋白表达，流式细胞学实验检测N型钙粘蛋白在心肌细胞表面的表达，利用黏附实验检测转染前后心肌细胞黏附能力的变化。结果成功构建ADAM10shRNA慢病毒载体，包装慢病毒，转导心肌细胞。与阴性对照组相比，转染组心肌细胞N型钙粘蛋白表达提高，CTF1片段表达减少；细胞表面N型钙粘蛋白的表达增多；心肌细胞黏附能力提高。结论初步证明心肌细胞中ADAMIO在N型钙粘蛋白的加工水解过程中发挥重要作用，为进一步明确该水解途径在维持心肌细胞形态结构和完整性方面所起的作用打下了实验基础。
- 李小鸥黄巍周丽荣
- 关键词：RNA干扰ADAM10慢病毒
- 野生型和突变型APP695稳定转染CHO分泌Aβ40和Aβ42的比较被引量：1
- 2013年
- 目的:建立野生型和瑞典突变型淀粉样蛋白前体695(APP695)稳定转染CHO细胞株,比较两者分泌Aβ40和Aβ42的能力,为筛选β分泌酶抑制剂奠定基础。方法:以人淀粉样蛋白前体751(APP751)基因序列为模板,通过突变分别获得野生型APP695wt和瑞典突变型APP695sw序列,再连入真核表达载体pcDNA3.1,转染CHO细胞并经G418筛选出稳转细胞株,通过ELISA法检测培养上清中Aβ40和Aβ42的含量,然后检测APPβ位点抗体对Aβ分泌的影响。结果:获得了APP695wt和APP695sw序列,构建载体并稳定转染的CHO细胞株,可检测到两种目的蛋白均有表达,相对分子质量约为98kDa。ELISA法只能检测到APP695sw稳转细胞有高水平Aβ40和Aβ42产生,Aβ40的分泌量约是Aβ42的24.57倍,可达约14000pg/ml。APPβ位点抗体可降低Aβ分泌量,但不影响Aβ40/Aβ42的比值。结论:成功获得APP695wt和APP695sw稳定转染细胞株,其中后者高分泌Aβ40和A42,适用于β分泌酶抑制剂的筛选。
- 黄巍周丽荣李小鸥孙红霞周婷黄晓刚刘桥
- 关键词：稳定转染
