李俊堂
- 作品数：4 被引量：13H指数：1
- 供职机构：第四军医大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 突变型人TRBP基因的构建及表达
- 2012年
- 目的:探讨RNAi过程中TRBP传递双链RNA的机制,构建RNA结合结构域突变的人TRBP基因真核表达载体。方法:设计突变引物,通过拼接PCR将突变型TRBP基因克隆入pFLAG-CMV4真核表达载体,经双酶切和测序鉴定正确后,命名为pFLAG-CMV4-TRBPm。瞬时转染HEK-293细胞,western-blot检测目的蛋白表达。结果:成功扩增了突变序列,构建了突变型TRBP基因的真核表达载体,转染HEK-293细胞后检测到带标签的目的蛋白表达。结论:突变型TRBP基因真核表达载体的成功构建,为进一步研究TRBP的生物学效应奠定了基础。
- 李俊堂王立锋王芳杨韬许彦鸣杨安钢
- 关键词：突变真核表达
- hsa-miR-128慢病毒载体的构建及其对胶质瘤细胞增殖的影响被引量：1
- 2012年
- 目的:构建含hsa-miR-128-1和hsa-miR-128-2前体的慢病毒表达载体,建立能够稳定表达目的基因的人胶质瘤U87细胞株。研究hsa-miR-128对胶质瘤细胞增殖的影响。方法:扩增hsa-miR-128前体片段,克隆入Pentr3c载体,利用LR clonaseⅡ酶将目的片段转接于Plenti6.3质粒,包装病毒,以改构的Plenti6.3-mCherry载体包装的病毒为对照,感染人胶质瘤U87细胞,通过Blasticidin筛选出能够稳定表达抗生素抗性的细胞株。荧光显微镜观察mCherry的荧光表达,实时荧光定量检测miR-128的表达量,流式细胞仪检测细胞周期,MTT检测细胞增殖。结果:成功构建重组慢病毒载体Plenti6.3-miR-128-1和Plenti6.3-miR-128-2,经Blasticidin筛选细胞株、mCherry荧光表达和实时荧光定量PCR验证,成功包装出慢病毒。病毒滴度测定在1.1×107-8.3×107TU/mL之间,细胞周期和MTT结果提示miR-128-1和miR-128-2高表达的U87细胞株均表现增殖抑制。结论:成功构建了分别含有两种hsa-miR-128前体的慢病毒表达载体,筛选出稳定表达hsa-miR-128的U87细胞株。miR-128-1和miR-128-2均抑制胶质瘤U87细胞增殖。
- 方丹东李俊堂杨韬张雷鸣皇甫罗锴王曦张剑宁杨安钢
- 关键词：U87细胞细胞增殖
- 干涉lncRNAs HOTAIR对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的影响被引量：12
- 2012年
- 目的:探讨利用RNA干涉沉默HOTAIR基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的影响。方法:利用脂质体转染MDA-MB-231细胞;qPCR检测HOTAIR基因的表达;检测EMT相关的Snail蛋白水平的表达;流式细胞术检测凋亡率;MTT法检测细胞增殖。结果:干涉HOTAIR基因后细胞中Snail蛋白表达水平下降,细胞凋亡增加。结论:靶向HO-TAIR的序列特异性siRNA可显著抑制HOTAIR基因的表达;干涉HOTAIR基因表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。
- 杨韬李俊堂王丽娟李伟郭张燕白文栋杨安钢
- 关键词：SNAIL
- 人TRBP基因在HEK-293细胞中的表达
- 2009年
- 目的:构建携带人TRBP(TAR RNA结合蛋白)基因的真核表达载体,并将其在HEK-293细胞中表达.方法:用RT-PCR的方法扩增获得TRBP全长cDNA,然后克隆入pFLAG-CMV4真核表达载体.脂质体法瞬时转染HEK-293细胞,间接免疫荧光和Western Blot检测目的蛋白表达.结果:成功获得了全长的TRBP cDNA,构建了含人的TRBP cDNA的真核表达载体.转染HEK-293细胞后提取蛋白,经电泳观察到在Mr46000存在与目的蛋白分子质量相符的条带,该条带可被抗TRBP多克隆抗体及抗FLAGmAb特异性识别.结论:TRBP哺乳动物表达系统的建立,为进一步研究TRBP的生物学效应奠定了基础.
- 李俊堂王立锋王芳许彦鸣杨安钢
- 关键词：TARRNA结合蛋白基因表达HEK-293细胞
