许彦鸣 作品数:74 被引量:187 H指数:7 供职机构: 汕头大学医学院 更多>> 发文基金: 国家自然科学基金 国家杰出青年科学基金 国家高技术研究发展计划 更多>> 相关领域: 医药卫生 生物学 文化科学 农业科学 更多>>
PTI-1表达载体构建及在大肠杆菌中的高效表达和纯化 被引量:2 2002年 目的 构建表达人前列腺癌诱导基因 1(PTI- 1)蛋白的重组质粒 ,在大肠杆菌中诱导高效表达并纯化 .方法 应用亚克隆 PTI- 1基因的 p U C19/ PTI- 1质粒 ,重新构建表达载体 PTI- 1/ p GEX4T- 1,酶谱分析鉴定出正确的重组质粒 ,诱导表达 ,进行 SDS- PAGE分析 ,应用 GSH树脂纯化表达产物 .结果 筛选出 5个与 p GEX4T- 1正向重组质粒 ,其中一株表达一个 Mr为 6 90 0 0的新蛋白 ,并以包涵体的形式存在 ,蛋白在宿主菌中高效表达 ,表达量为 43.2 %,纯化蛋白得到纯度为 79.72 %的 GST/ PTI- 1融合蛋白 .结论 重组质粒 PTI- 1/PGEX4T- 1的构建和 GST/ PTI- 1融合蛋白高效表达及纯化的成功使简便获得前列腺癌诱导蛋白成为可能 . 付振虹 王禾 武国军 许彦鸣 袁建林 王成济 杨安钢关键词:大肠杆菌 纯化 前列腺肿瘤 基因 基因表达 重组人肿瘤坏死因子-α联合肿瘤坏死因子受体1基因转染杀伤舌癌细胞的实验研究 被引量:4 2004年 目的 :观察重组人肿瘤坏死因子 α(rhTNF α)对建系细胞 (T T)作用效应与机制。方法 :反转录PCR方法克隆人TNFR1基因 ,并将其稳定转染入舌癌细胞中 ,建系并鉴定 ;通过MTT法检测、DNA降解片段琼脂糖凝胶电泳及电镜观察检测rhTNF α对T T细胞的作用效果与机制。结果 :成功构建含TNFR1基因的真核表达质粒 pcDNA3 TNFR1,并建立表达TNFR1蛋白活性的舌癌细胞系T T ;较之亲本Tca 8113细胞及转染空载体的T pc细胞 ,rhTNF α对T T细胞具有更强的细胞毒作用 ,且通过介导细胞凋亡的方式发挥其作用。结论 :重组人肿瘤坏死因子 α联合肿瘤坏死因子受体 1基因转染可有效地杀伤舌癌细胞 ,为舌癌基因治疗提供理论依据。 刘大庆 司徒镇强 曹云新 许彦鸣 于翠娟 王成济 杨安钢关键词:肿瘤坏死因子受体 肿瘤坏死因子 舌癌细胞 分泌表达的抗ErbB2单链抗体与重构型人半胱氨酸蛋白水解酶3融合蛋白对SKBr3细胞的靶向杀伤作用 被引量:1 2003年 目的 探讨分泌表达的抗erbB2单链抗体与重构型人半胱氨酸蛋白水解酶 (caspase 3)融合蛋白对ErbB2抗原阳性肿瘤细胞的靶向杀伤作用。方法 将重构型人caspase 3基因亚克隆入pCMV e2 3scFv PEII PEIII相应位点 ,构建表达分泌型的抗erbB2单链抗体与重构型人caspase 3融合蛋白基因的真核表达载体 pCMV e2 3scFv PEII revcasp 3,转染人T淋巴瘤细胞系Jurkat,筛选并建系 ,ELISA检测培养上清中融合蛋白的分泌表达以及对人乳腺癌细胞SKBr3生长的抑制作用 ,并将重组质粒经脂质体包裹后肌肉注射荷瘤裸鼠研究其对肿瘤的抑制作用 ,间接免疫荧光检测重构型人caspase 3蛋白在瘤体的靶向分布。结果 融合蛋白基因可通过Jurkat细胞分泌表达并杀伤SKBr3细胞 ,肌肉注射重组质粒明显延长荷瘤裸鼠生存时间 (延长 72 % )和抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长 (抑制率为77% )。间接免疫荧光染色显示重构型人Caspase 3融合蛋白具有靶向分布。结论 分泌表达的抗erbB2单链抗体与重构型人Caspase 3融合蛋白靶向诱导SKBr3细胞死亡。 张立红 贾林涛 于翠娟 曲萍 董海龙 赵晶 许彦鸣 王成济 杨安钢关键词:分泌表达 融合蛋白 靶向杀伤作用 CASPASE-3 基因疗法 针对HER2/neu的siRNA对非小细胞肺癌细胞生长的抑制作用 被引量:4 2006年 目的:构建针对HER2/neu的RNA干涉载体,观察对HER2/neu表达抑制及抑制后对非小细胞肺癌生长的影响.方法:设计和合成长度为64nt的脱氧寡核苷酸链,退火互补成双链,克隆至pSUPER质粒载体,转化DH5α菌株,提取质粒,转染过表达HER2/neu的肺腺癌细胞系SPCA1,RTPCR检测HER2/neu的mRNA表达,Westernblot和间接免疫荧光法检测HER2/neu的蛋白表达,FCM分析细胞周期变化,MTT法观察细胞生长.结果:肺腺癌细胞系SPCA1存在HER2/neu过表达;成功构建了HER2/neu特异性RNA干涉载体pSUPERsiHER2;瞬时转染SPCA1细胞,HER2/neu的mRNA及蛋白表达均降低;G1期细胞较亲代增加9.9%;肿瘤细胞增殖速度减慢(P<0.05).结论:成功构建了HER2/neuRNA干涉载体,转染后可有效降低肺腺癌细胞系SPCA1HER2/neu的mRNA转录及蛋白水平表达,阻滞转染细胞于G1期,造成转染细胞生长速度减慢,这有望为肺癌基因治疗提供一种选择手段. 任新玲 钱桂生 鲍炜 付海京 贾林涛 张瑞 王涛 许彦鸣 杨安钢关键词:SIRNA RNA干涉 HER2/NEU 癌细胞生长 人fadd基因cDNA的克隆和诱导舌癌细胞凋亡的研究 被引量:1 2002年 目的 :观察人 fadd基因对舌癌 (Tca 8113 )细胞的凋亡诱导作用。方法 :用反转录PCR获取人fadd基因 ,将基因克隆入真核表达载体 pcDNA3和 pIRES2 EGFP中 ,脂质体法转染舌癌细胞 ,通过细胞计数、荧光显微镜及电镜观察、流式细胞仪等检测被转染细胞的生长及其凋亡状况。结果 :成功获取了人fadd基因。与对照组相比 ,在转染 1~ 3d内 ,fadd基因的表达导致舌癌细胞存活数目减少 ,大量细胞发生凋亡。结论 :人 fadd基因可以诱导转染的舌癌细胞发生凋亡。 刘大庆 司徒镇强 许彦鸣 曹云新 于翠娟 王成济 杨安钢关键词:克隆 舌癌 细胞凋亡 基因疗法 NT3基因工程细胞经脑脊液途径的耳蜗内生物学效应的初步证明 被引量:15 2002年 目的 通过脑脊液途径移植神经营养因子 - 3(NT3)基因工程细胞 ,初步观察其耳蜗内听觉生物学效应。方法 将体外构建的NT3基因工程细胞扩大培养 ,收集浓缩培养上清中的蛋白 ,用印迹杂交鉴定其分泌蛋白的生物学效应 ,再将适当的细胞直接移植到 2 0天龄近交BALB/C小鼠的脑脊液中 ,4 0天后比较移植前后的畸变产物耳声发射 (DPOAE)幅值。结果 体外构建NT3基因工程细胞是可行的 ,其具备分泌NT3的功能 ,经脑脊液途径注射后观察到BALB/C小鼠耳蜗功能的老化在高频范围内得到了延缓 ,DPOAE高频范围幅值下降减缓。结论 NT3基因工程细胞具有较好的体外体内生物学效应 ,可以用于进一步实验治疗感音性聋的研究 ; 高下 王锦玲 杨安钢 金明 许彦鸣 王枫关键词:生物学效应 神经营养因子-3 基因转染 基因工程细胞 耳蜗 感音性聋 重构型caspase-3的表达及其对SKBr3细胞的凋亡诱导作用 被引量:2 2002年 目的:探讨重构型caspase-3基因的表达对肿瘤细胞的凋亡诱导作用。方法:用重组PCR的方法获得大、小亚基顺序颠倒的重构型caspase-3基因并将其克隆入真核表达载体pcDNA3,转染乳腺癌细胞系SKBr3细胞,通过HE染色、流式细胞仪分析及免疫组化等方法观察其表达后对细胞的促凋亡活性,并将载体DNA直接注射荷瘤裸鼠研究其对肿瘤的抑制作用。结果:重构型caspase-3基因可在SKBr3细胞内表达,转染组较同期对照组出现明显的细胞死亡现象,pcDNA3-revcasp-3重组质粒直接注入对荷瘤裸鼠肿瘤生长有明显抑制作用。结论:重构型caspase-3基因表达可诱导SKBr3细胞凋亡。 张立红 贾林涛 陈广生 曲萍 于翠娟 赵晶 许彦鸣 王成济 杨安钢关键词:凋亡 SKBR3 乳腺癌 肿瘤细胞 重组抗HER2 ScFv/tbid基因的表达及其对乳腺癌SKBr-3细胞的促凋亡作用 被引量:1 2006年 目的:观察构建的重组抗HER2ScFv/tbid基因在SKBr-3细胞中的表达及其对转染的SKBr-3细胞的作用.方法:用限制性内切酶双酶切已构建的pcDNA-bid质粒,获得带有PE转膜结构域和tbid的重组基因,将所获基因插入到真核表达载体pCMV单链抗体基因ScFv23e的下游,转染SKBr-3细胞.间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达,MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况.结果:转染SKBr-3细胞后,检测出目的蛋白的表达.MTT实验发现细胞的增殖被明显抑制.间接免疫荧光双标记染色检测tBid的表达,并可观察到Cytc在细胞质中存在,SKBr-3细胞出现凋亡.结论:重组抗HER2ScFv/tBid分子可以在转染的SKBr-3细胞中表达,并且可抑制转染细胞的生长,诱导细胞发生凋亡. 王芳 裘秀春 王立锋 许彦鸣 赵晶 孟艳玲 贾林涛 王成济 范清宇 杨安钢关键词:BID 乳腺肿瘤 重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用 被引量:1 2008年 目的:构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,并探讨其对骨肉瘤E10细胞的促调亡作用。方法:通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪(FCM)检测E10细胞膜表面HER2的表达。将抗HER2单链抗体基因e23sFv与铜绿假单胞菌外毒素PE的转膜结构域基因(PEⅡ)和tBid基因连接,构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,将其克隆入真核表达载体pCMV中构建重组pCMV-ScFv/tBid载体,转染骨肉瘤E10细胞。间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化,Annexin V染色流式细胞术及TUNEL法检测E10细胞的凋亡情况。结果:流式细胞仪检测到E10细胞膜表面有HER2的表达。成功构建重组融合蛋白基因质粒pCMV-ScFv/tBid。重组质粒转染E10细胞后,间接免疫荧光双标记染色检测到E10细胞中tBid的过表达;细胞色素C在细胞质中出现;细胞出现明显的固缩、核浓缩等形态特征。Annexin V染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高(16.1% vs 4.5%);TUNEL染色显示,E10细胞出现典型的凋亡特征。结论:重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid可以在转染的骨肉瘤E10细胞中表达,并诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。 裘秀春 单乐群 纪振钢 杨彤涛 龙华 许彦鸣 周勇 马保安 杨安钢 范清宇关键词:TBID 人表皮生长因子受体2 融合蛋白 骨肉瘤细胞 针对HBV X基因的siRNA高效抑制HepG2.2.15细胞和转基因小鼠中HBV的基因表达和复制 <正>RNA干涉是双链RNA介导的、序列特异的转录后基因沉默现象。由于能够高效特异地关闭或降低特定基因的表达,且具有特异性高、起效快、作用效果强等特点,使得RNAi 杨安钢 刘家云 温伟红 赵晶 贾林涛 许彦鸣 孟艳玲文献传递