刘婕
- 作品数：18 被引量：14H指数：2
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京市自然科学基金北京市科技新星计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- Twist1稳定表达细胞株的建立及对乳腺癌细胞上皮-间充质转变的影响被引量：2
- 2016年
- 目的:构建Twist1的慢病毒真核表达载体,并建立稳定表达Twist1的乳腺癌细胞株,研究Twist1在乳腺癌中对上皮-间充质转变(EMT)的影响。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增Twist1编码序列,克隆到慢病毒p CDH载体,构建成p CDH-Twist1,转染293T细胞,Western印迹鉴定p CDH载体介导的Twist1的表达;包装病毒载体,感染ZR75-1细胞,用嘌呤霉素筛选得到稳定表达Twist1的细胞株,检测ZR75-1细胞对EMT的影响。结果:经Bam HⅠ、Eco RⅠ双酶切及测序证实得到p CDH-Twist1表达载体,Western印迹实验发现Twist1在293T细胞内表达;嘌呤霉素筛选得到稳定表达Twist1的ZR75-1细胞株。结论:构建了p CDH-Twist1的真核表达载体并建立了稳定表达Twist1的ZR75-1细胞,为进一步研究Twist1在EMT过程中的机制奠定了基础。
- 宋玉华陈滢洁张亚楠刘婕罗晓丽贾晓蒙李欣姜潇丁丽华叶棋浓
- 关键词：TWIST1E-钙黏蛋白乳腺癌细胞
- 核输入蛋白α/β真核表达载体的构建及细胞内定位被引量：1
- 2015年
- 目的:构建带有myc标签的核输入蛋白(importin)α/β的真核表达载体,转染人胚肾293T细胞并分析其表达。方法:以乳腺癌文库为模板PCR扩增核输入蛋白α/β基因,扩增产物插入真核表达载体p XJ-40-myc,经双酶切和测序鉴定;将空载体与重组质粒分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和免疫荧光技术检测核输入蛋白α/β的表达。结果:酶切鉴定与测序结果表明构建的myc-Importinα/β真核表达载体正确;Western印迹检测到重组质粒在293T细胞中的表达;免疫荧光检测到核输入蛋白α定位于细胞质和细胞核,而核输入蛋白β定位于细胞核。结论:构建了核输入蛋白α/β的真核表达载体,并确定了其在细胞中的表达定位。
- 罗晓丽周蕾丁丽华张亚楠刘婕贾晓蒙陈滢洁熊加秀陈志达叶棋浓赵丽纯
- 关键词：克隆细胞定位
- 组蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测
- 2013年
- 目的:构建组蛋白H2A、H2B、H3、H4的酵母双杂交诱饵载体,检测其在酵母细胞中的表达和自激活活性,为应用酵母双杂交系统筛选与组蛋白相互作用的蛋白奠定基础。方法:扩增H2A、H2B、H3、H4蛋白基因编码区cDNA序列,克隆至酵母表达载体pGBK-T7中,再将其转化至酵母细胞AH109中,提取酵母总蛋白,检测各种组蛋白的表达,并检测表达的组蛋白在酵母细胞中对报告基因有无自激活作用。结果:将H2A、H2B、H3、H4基因的cDNA克隆至酵母表达载体pGBK-T7中,其中组蛋白H4得到正确表达,且对报告基因LacZ、HIS3、Ade无激活作用。结论:可以利用酵母双杂交系统筛选与H4相互作用的蛋白质。
- 李玮妮李法曾张浩陈立涵程龙徐小洁刘婕叶棋浓
- 关键词：组蛋白酵母双杂交表观遗传
- p300基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-1细胞的影响
- 2014年
- 目的:构建p300基因的小干扰RNA(siRNA)慢病毒表达载体,检测其对p300蛋白表达的干扰,以及对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术设计并合成针对p300基因的siRNA,并将其克隆到siRNA表达载体pSIH-H1上,经酶切和测序验证,用293T人胚肾细胞包装p300 siRNA慢病毒,感染乳腺癌细胞ZR75-1,建立敲低p300表达的稳定细胞株,通过实时定量PCR和Western印迹检验RNAi的干扰效果,利用细胞生长实验检测p300 siRNA对ZR75-1细胞生长的影响。结果:酶切和测序证明构建了p300 siRNA真核表达载体;实时定量PCR和Western印迹证明构建的siRNA能有效抑制p300基因的表达,并建立了敲低p300表达的稳定细胞株;细胞生长实验证实p300 siRNA可有效促进ZR75-1细胞的生长。结论:构建了p300基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效抑制p300基因的表达,且能促进ZR75-1细胞的生长,表明构建的p300 siRNA具有功能。
- 陈志达丁丽华张亚楠刘婕朱杰叶棋浓卫勃
- 关键词：小干扰RNA慢病毒载体
- GFP-LC3B真核表达载体的构建及表达鉴定
- 2015年
- 目的:构建人自噬相关基因LC3B的真核表达载体p EGFP-C1-LC3B,并鉴定其表达。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增LC3B全长基因,将其克隆至p EGFP-C1表达载体,得到p EGFP-C1-LC3B重组质粒,酶切和测序鉴定后,转染ZR75-1细胞,Western印迹检测真核细胞中GFP-LC3B融合蛋白的表达,用倒置荧光显微镜观察自噬诱导剂雷帕霉素处理和未处理ZR75-1细胞质中GFP-LC3B的分布。结果:Western印迹可见GFP-LC3B融合蛋白表达条带;在荧光显微镜下,ZR75-1细胞内可见绿色荧光,雷帕霉素刺激后有明显绿色荧光聚集体形成。结论:人自噬相关基因LC3B的真核表达载体p EGFP-C1-LC3B构建成功,为进一步研究自噬在乳腺癌细胞中的作用机制奠定了基础。
- 朱杰丁丽华刘婕禾荣华张亚楠陈志达罗晓丽叶棋浓吕朝晖
- 关键词：自噬真核表达载体绿色荧光蛋白
- DEK基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其功能鉴定被引量：2
- 2015年
- 目的构建DEK基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法采用RNAi技术,根据DEK基因的序列,确定其有效靶序列,合成DEK基因的Oligo DNA,退火形成双链DNA,将其克隆到经Bam HⅠ与EcoRⅠ酶切后的小干扰RNA(siRNA)表达载体PSIH-H1上,产生PSIH-H1-DEK慢病毒载体,筛选阳性克隆并测序鉴定。与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染乳腺癌细胞ZR75-1,经嘌呤霉素(puromycin,puro)筛选2周后,收集部分细胞利用实时聚合酶链反应(real time-PCR,RT-PCR)和Western印迹分别检验DEK在信使RNA(mRNA)和蛋白水平的敲低效果,并通过细胞生长实验检测DEK对人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞生长的影响。结果 PCR和DNA测序结果证实,DEK siRNA慢病毒表达载体PSIH-H1-DEK构建成功。RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的DEK siRNA可有效抑制DEK基因的表达,并由此建立了敲低DEK的稳定克隆。生长曲线实验表明,DEK siRNA可抑制人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞的生长。结论成功构建了DEK基因的RNAi慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞后,有效沉默了ZR75-1细胞中的DEK基因的表达,为进一步研究DEK基因在乳腺癌中的作用奠定基础。
- 朱杰刘婕丁丽华禾荣华张亚楠陈志达罗晓丽叶棋浓吕朝晖
- 关键词：RNA干扰慢病毒载体
- VEGF启动子活性的测定被引量：2
- 2013年
- 目的构建含有VEGF基因的不同片段启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测VEGF启动子不同片段的活性。方法用PCR扩增出VEGF启动子的不同片段,插入到荧光素酶报告基因载体pGL4-basic中,确定所扩增的DNA序列后,将其转染至293T细胞中,检测其不同片段的活性。结果测序结果表明,扩增的不同片段的VEGF启动子序列正确;荧光素酶活性实验表明,VEGF启动子+72～-128 bp至+72～-528 bp片段具有较高的活性。结论构建了VEGF启动子5'端缺失不同片段突变体报告基因表达载体,为VEGF转录因子的筛选及功能研究提供了重要基础。
- 刘婕林娅红张亚楠丁丽华叶棋浓
- 关键词：荧光素酶报告基因转录活性
- 慢病毒介导的敲低UBC9表达抑制ERβ类泛素化修饰水平被引量：3
- 2013年
- 目的建立稳定敲低UBC9蛋白表达的293T细胞株,检测其对雌激素受体β(ERβ)类泛素化修饰水平的调节作用。方法构建4条针对人UBC9基因的慢病毒短发夹RNA(shRNA)的干扰载体,将其与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞后,收集病毒上清,感染293T细胞,经嘌呤霉素(puromycin)筛选后获得稳定表达慢病毒介导UBC9 shRNA的混合细胞集落,分别用实时(real-time)PCR和Western印迹方法检测UBC9的表达情况,瞬时转染方法检测UBC9表达水平对ERβ类泛素化修饰水平的影响。结果建立了稳定敲低UBC9的293T细胞株,UBC9降低能够抑制ERβ类泛素化修饰水平。结论 UBC9在ERβ类泛素化修饰反应中发挥重要作用。
- 李玮妮陈立涵程龙徐小洁付洁关鑫刘婕张浩叶棋浓
- 关键词：慢病毒属UBC9ERΒRNA干扰
- DEK真核表达载体的构建及其对p53启动子活性的影响
- 2013年
- 目的:构建DEK的pcDNA3-Flag表达载体,研究其对抑癌基因p53启动子活性的影响。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增DEK编码序列,克隆到pcDNA3-Flag载体,构建成pcDNA3-Flag-DEK,转染293T细胞,Western印迹鉴定pcDNA3-Flag载体介导的DEK的表达,萤光素酶报告基因活性实验研究DEK对p53启动子活性的影响。结果:双酶切实验证实得到pcDNA3-Flag-DEK阳性克隆;Western印迹实验发现DEK在293T细胞内表达;转录活性实验表明在ZR75-1乳腺癌细胞中,DEK呈剂量依赖性抑制p53启动子的活性。结论:构建了DEK的真核表达载体,并发现此表达载体能在ZR75-1乳腺癌细胞中抑制p53启动子活性。
- 刘婕闫志风张亚楠林娅红丁丽华叶棋浓
- 关键词：DEK萤光素酶报告基因
- 血管内皮细胞生长因子启动子突变体萤光素酶报告基因载体的构建
- 2013年
- 目的:构建含有不同片段血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因的启动子的萤光素酶报告基因载体,并定位缺氧诱导因子1α(HIF-1α)结合VEGF启动子的区域。方法:以VEGF全长启动子为模板,PCR扩增VEGF启动子的不同片段,插入萤光素酶报告基因载体pGL4-basic,确定所扩增的DNA序列后,将其与HIF-1α表达载体共转染293T细胞,定位HIF-1α结合VEGF启动子的区域。结果:测序结果表明扩增的不同片段的VEGF启动子序列正确;萤光素酶活性实验表明,-1128^-728 bp片段是HIF-1α与VEGF相互作用激活VEGF启动子转录活性的区域。结论:克隆了VEGF启动子5'端缺失突变体报告基因表达载体,为调控VEGF表达的转录因子的筛选及功能研究打下了良好基础。
- 张述刘婕刘世翠林娅红张亚楠丁丽华叶棋浓
- 关键词：血管内皮细胞生长因子启动子萤光素酶报告基因转录活性
