王鹏程
- 作品数：17 被引量：26H指数：3
- 供职机构：军事医学科学院微生物流行病研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- pSFV1载体系统的改造
- 2001年
- 目的 获得具有多种稀有酶位点和CMVIE增强子 启动子及SV40晚期poly(A)加尾信号的pSFV1载体系统。方法 首先将含有多种稀有酶位点的人工接头插入到pSFV1的BamHⅠ和SmaⅠ位点 (获得的载体称为mpSFV1) ,然后在mpSFV1和辅助载体Helper2的SpeⅠ和SphⅠ位点分别插入SV40晚期poly(A)加尾信号和CMVIE增强子 启动子序列。以间接免疫荧光法检测构建的表达载体mpSFV1 A CMV表达登革 2型病毒PrME基因的效率 ,并用RT PCR法鉴定辅助载体Helper2 A CMV包装形成重组病毒的能力。结果 经PCR和酶切鉴定证明 ,接头、CMVIE增强子 启动子序列和SV40晚期poly(A)加尾信号序列均已导入pSFV1载体系统中 ;测序结果也与已知序列一致。间接免疫荧光法证明 ,PrME蛋白在BHK2 1细胞中获得了表达 ,同时 ,改造后的辅助载体也具有包装形成重组病毒的能力。结论 已将以RNA为基础的pSFV1载体系统构建成以DNA为基础的表达载体系统。
- 陈水平秦鄂德于曼赵卫范宝昌胡志君王鹏程杨佩英
- 关键词：启动子登革病毒
- 登革2型病毒全长cDNA克隆定点诱变的OL-PCR方法被引量：3
- 2001年
- 目的 对带有登革 2型病毒 (DEN 2 )全长cDNA的质粒pDVWS5 0 1上E6 2、E2 0 3位点进行定点诱变。方法 设计 4对点诱变引物 ,运用OL PCR(overlapPCR)法 ,扩增出分别在E6 2或E2 0 3位带有点突变的 2条DNA片段 ,克隆至T载体 ,获T TB6 2、T TB2 0 3两个克隆。将T TB6 2用ClaⅠ和SphⅠ分别酶切 ,T TB2 0 3用SphⅠ +NheⅠ酶切后 ,用T4连接酶分别连接至pDVWS5 0 1,获重组质粒TB6 2和TB2 0 3。对TB6 2和TB2 0 3进行序列测定。结果 成功得到分别在E6 2、E2 0 3位带有点突变的TB6 2、TB2 0 3克隆。结论 OL
- 赵卫胡志君杨佩英秦鄂德于曼陈水平王鹏程耿丽卿范宝昌
- 关键词：登革2型病毒CDNA克隆定点诱变登革热病毒
- 我国登革 4型病毒 B5株基因组全序列的测定及分析(英文)被引量：5
- 2001年
- 对我国登革 4型病毒 B5株 (D4- B5)基因组进行全序列测定及分析 ,为研究病毒基因组结构与功能的关系及研制新型登革疫苗奠定基础 .根据登革 4型病毒 81 4669株的序列设计特异引物 ,通过 RT- PCR扩增出 D4- B5株不同长度的片段 ,分别克隆到 p GEM- T载体 ,将挑取的阳性克隆进行 PCR、酶切鉴定及序列测定 .结果显示 ,D4- B5株的基因组全长 1 0 665nt,5′和 3′非编码区分别为 1 0 1 nt和 40 3nt,中间一个长 1 0 1 61 nt的开放读码框架 ,编码 3387个氨基酸 .与 D4- 81 4669株比较 ,两者核苷酸序列同源性为 93.0 8% ,氨基酸序列同源性为 96.58% .D4- B5株的基因组全序列与 D4- 81 4669株类似 ,但也有较大差异 .同源进化分析表明 ,D4- B5株的基因型为 型 ,与登革 4型病毒菲律宾分离株亲缘关系较近 .这是首次报道的我国登革 4型病毒分离株基因组全序列 ,对研究病毒基因组结构与功能的关系 ,探讨我国毒株的地理来源及研制适合我国人群的新型登革疫苗具有一定的意义 .
- 王鹏程秦鄂德于曼耿丽卿赵卫胡志君苑锡同杨佩英
- 关键词：登革病毒基因组
- 我国登革2型病毒毒力的多位点控制
- 04株是我国自行分离的无乳鼠神经毒力的登革2型病毒,其E蛋白62、203位分别为Glu、Asp.pDVWS501为含有登革2型病毒全长cDNA的质粒,可经体外转录、转染BHK-21细胞回复为有活力的病毒MON501.MO...
- 赵卫范宝昌胡志君陈水平王鹏程李晓萸于曼秦鄂德杨佩英
- 文献传递
- 我国D2-43病毒株PrM-E基因的复制型载体质粒DNA的免疫原性(英文)被引量：1
- 2002年
- 观察含我国登革 2型病毒株 (D2 4 3)的PrM E基因的复制型SFV(semlikiforestvirus)重组质粒DNA的免疫原性 ,为登革新型疫苗的研制提供依据 .将PrM E基因自T载体上切下 ,插入复制型SFV病毒载体质粒DNA中 .将此重组质粒DNA以电穿孔法导入BHK2 1细胞 ,用间接免疫荧光法在感染细胞内可检测到登革 2型病毒特异蛋白的表达 .采用去除内毒素的质粒提取试剂盒制备重组质粒DNA ,然后以不同剂量通过肌肉多点注射途径免疫Balb c鼠 ,获得的鼠血清可与登革D2 4 3感染的C6 36抗原片起特异的抗原抗体反应 .结果表明 ,含登革 2型病毒PrM E基因的复制型SFV病毒载体质粒DNA在Balb c鼠中可诱导登革 2型病毒特异抗体的产生 ,但抗体水平较低 .
- 陈水平秦鄂德于曼胡志君赵卫范宝昌王鹏程杨佩英
- 关键词：免疫原性登革病毒DNA免疫
- 新分离的无乳鼠神经毒力的登革2型病毒福建株基因组结构特征的研究
- 2002年
- 目的 测定对乳鼠不致病登革 2型病毒福建株 (DEN2 FJ11)全基因组序列 ,探讨其基因组结构与功能关系。方法 采用RT PCR和 5′、3′端RACE方法测定病毒基因组的全序列 ,并运用DNASTAR软件的Clustal法将该毒株的序列与其它 6株登革 2型病毒进行比较 ,分析其进化关系。结果 DEN2 FJ11株基因组全长 10 72 3个核苷酸 ,含有 1个单一的读码框架 ,编码 3391个氨基酸。 5′、3′端非编码区 (NCR)长度分别为 96和 45 4个核苷酸。DEN2 FJ11与同时分离的对乳鼠致病的FJ10株之间共有 32个核苷酸不同及 13个氨基酸的变化 ,其中 8个氨基酸是其极性或电荷的改变。 3′端非编码区 134位的单个核苷酸变化导致其二级结构改变。DEN2 FJ11与FJ10株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为 99.7%和 99.6 %,这 2株病毒与印度尼西亚株亲缘关系最近 ,同为Ⅳ基因型。结论 DEN2 FJ11株基因组与FJ10株及其它登革 2型病毒株类似。位于病毒编码区的 8个氨基酸差异及 3′端非编码区 134位的核苷酸可能与病毒的乳鼠神经毒力有关。
- 于曼赵月峨胡志君苑锡同耿丽卿赵卫范宝昌王鹏程陈水平段鸿元杨佩英秦鄂德
- 关键词：全基因组登革热
- 我国登革2型/4型病毒株嵌合E基因免疫原性的研究被引量：2
- 2001年
- 目的构建含有我国登革2型/4型病毒株嵌合E基因片段的真核表达质粒,观察重组质粒DNA的免疫原性,为登革多价疫苗的研究提供依据。方法首先将包含我国登革2型病毒43株E蛋白I/II抗原区和4型病毒B5株E蛋白III抗原区的嵌合E基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,通过测序确定嵌合基因序列的正确性。然后将重组质粒以肌肉注射途径,免疫Balb/C小鼠。通过间接免疫荧光法对采集的鼠血清中的病毒特异抗体进行检测。结果构建的含有我国登革2型/4型病毒株嵌合E基因的真核表达质粒pcDNA-D2/4,经序列测定表明,导入的嵌合E基因片段的序列是正确的。将重组质粒DNA免疫小鼠,在初次免疫后的第3周,可同时检测到针对登革2型和4型病毒的特异荧光。结论所构建的含有不同血清型的我国登革病毒株嵌合E基因片段的真核重组质粒,可诱导小鼠同时产生针对两个血清型病毒的特异抗体,该研究为新型登革多价疫苗的研制提供了依据。
- 王鹏程秦鄂德于曼赵卫胡志君陈水平杨佩英
- 关键词：登革病毒登革2型病毒登革4型病毒免疫原性
- 登革2型型内嵌合病毒HFT04/501乳鼠神经毒力特征的研究
- 2002年
- 赵卫范宝昌胡志君陈水平王鹏程苑锡同李晓萸于曼秦鄂德杨佩英
- 关键词：电穿孔法体外转录
- 我国D2-43株PrM-E基因的复制型载体质粒DNA的免疫原性研究被引量：2
- 2001年
- 目的通过观察含我国登革2型病毒株D2-43的PrM-E基因的复制型SFV重组质粒DNA的免疫原性,为登革新型疫苗的研制提供依据。方法将PrM-E基因自T载体上切下,插入复制型SFV病毒载体质粒DNA中。将此重组质粒DNA以电穿孔法导入BHK21细胞,表达产物的特异性用间接免疫荧光法进行鉴定。采用去除内毒素的质粒提取试剂盒制备重组质粒DNA,然后以不同剂量通过肌肉注射途径免疫Balb/c鼠,鼠血清中的抗体用间接免疫荧光法进行检测。结果含PrM-E基因的重组SFV质粒DNA在BHK21细胞中可表达登革2型病毒的特异蛋白;经免疫Balb/c鼠后,鼠血清可与登革D2-43感染的C6/36抗原片起特异的抗原抗体反应。结论含登革2型病毒PrM-E基因的复制型SFV病毒载体质粒DNA在Balb/c鼠中可诱导登革2型病毒特异抗体的产生,但抗体水平较低。
- 陈水平秦鄂德于曼胡志君赵卫范宝昌王鹏程杨佩英
- 关键词：登革病毒DNA免疫
- 登革2型病毒乳鼠神经毒力相关位点的研究
- 2002年
- pDVWS501为含有登革2型病毒全长cDNA的质粒,可利用感染性转录体技术恢复为有活力的病毒MON501.将MON501注射乳鼠脑内可引发脑炎症状,其E蛋白的62,203位分别为Glu,Asn.采用OL-PCR方法把pDVWS501 E62位氨基酸突变为Lys,得到质粒TB62;E203位氨基酸突变为Asp,得到质粒TB203.将pDVWS501,TB62和TB203酶切后体外转录得到全长登革2型病毒转录体,应用电穿孔技术转染BHK-21细胞,7天后收毒.RT-PCR证实有登革2型病毒存在,接种C6/36细胞,3～5 d可使其产生典型病变.测定突变区域的序列,结果表明得到了恢复病毒MON501和E62,E203位点突变的重组病毒HFT62,HFT203.3株病毒均在其基因组5’端加“G”,3’端则与登革2型病毒野生株相同.分别将3株病毒稀释至105～102TCID50,经脑内途径注射1日龄乳鼠,发现与MON501相比,HFT62,HFT203在同一稀释度发病乳鼠的个数减少,发病时间延长且差异显著,表明E62,E203可能是登革2型病毒乳鼠神经毒力相关位点.
- 赵卫范宝昌胡志君陈水平王鹏程苑锡同李晓萸于曼秦鄂德杨佩英
- 关键词：乳鼠神经毒力登革2型病毒点突变登革热
