黄莺
- 作品数：15 被引量：99H指数：5
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 日本脑炎病毒(JEV)复制子表达载体的构建及其鉴定被引量：7
- 2007年
- 在以往构建的JEV疫苗株SA14-14-2感染性克隆pBRkpn-JTF的基础上,构建了去除JEV结构区域基因(prM基因和E基因),保留非结构区域基因的复制子表达载体pCTCJEV、pCTMJEV,转染BHK-21细胞后,通过反转录PCR(RT-PCR)和间接免疫荧光实验(IFA)检测该载体的自主复制能力和蛋白表达情况,结果证实该载体在BHK-21细胞中能够自主复制并且表达非结构蛋白。进一步在该载体中插入报告基因EGFP,检测外源蛋白的表达情况,结果显示在转染复制子载体的24h后,荧光显微镜下能够看见绿色荧光蛋白的表达,阳性信号持续增强,能够维持10d左右,证实了构建的复制子载体pCTCJEV能够有效地表达外源蛋白,这为进一步建立以乙脑病毒复制子为基础的疫苗载体系统打下基础。
- 黄莺邵炜贾丽丽俞炜源俞永新
- 关键词：日本脑炎病毒外源蛋白
- 流行性乙型脑炎减毒活疫苗生产毒种(SA14-14-2株)及其疫苗的表型和E基因稳定性研究被引量：11
- 2004年
- 目的 对乙脑减毒活疫苗SA14 14 2株生产毒种及其疫苗病毒滴度、脑内毒力和E区核苷酸序列进行回顾性测定。方法 应用乳金黄地鼠肾传代细胞 (BHK 2 1)结晶紫蚀斑法进行病毒滴度的测定 ,小鼠脑内法检测疫苗脑内毒力。应用RT PCR方法扩增SA14 14 2生产毒种和疫苗E区的核苷酸 ,经凝胶层析纯化的PCR产物直接用于测序或克隆到pGEM T载体中 ,经酶切和PCR鉴定后进行测序。结果 疫苗在 - 2 0℃保存长达 10多年 ,疫苗病毒滴度下降不超过 0 5lg;脑内毒力未见毒力回升。病毒蚀斑形态仍保持较SA14野毒株形态小的特性 ;以不同批次疫苗和生产毒种提取的病毒RNA作为模板进行RT PCR扩增 ,扩增的基因片段与预期大小一致 ;E区基因序列与野毒株差异的 8个氨基酸没有一个发生回复突变。结论 SA14 14
- 贾丽丽俞永新黄莺王志伟岳广智郑铮董关木
- 关键词：流行性乙型脑炎减毒活疫苗表型毒种
- 利用Red重组系统对大肠杆菌ClpP基因的敲除被引量：37
- 2005年
- 利用含有质粒pKD4 6的菌株BW2 5 113,在阿拉伯糖诱导后 ,表达λ噬菌体的 3个重组蛋白 ,宿主菌就具有了同源重组的能力 .设计的引物 5′端有 5 0bp的拟敲除基因的同源臂 ,3′端为扩增引物 ,以pKD3为模板 ,扩增两侧含FRT位点的氯霉素抗性基因 ,将此线性片段电转入具重组功能的感受态细胞 ,利用氯霉素平板就可以筛选到阳性转化体 .再利用表达Flp重组酶的质粒pCP2 0 ,可将FRT位点之间的氯霉素抗性基因删除 .利用该重组系统 ,构建了ClpP蛋白酶缺失的大肠杆菌工程菌株 ,可望在减少外源蛋白的降解方面发挥一定的作用 .
- 白光兴孙志伟黄莺俞炜源
- 关键词：CLPP
- 稳定表达乙脑病毒结构蛋白的细胞系的建立被引量：2
- 2009年
- 以乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株全长基因组克隆质粒pBR-JTF为模板,通过PCR分别扩增prM-E及C-prM-E基因片段,构建表达乙型脑炎病毒结构蛋白的真核表达质粒pCJE-ME及pCJE-CME。将这2种重组质粒用脂质体法转染BHK-21细胞后,质粒pCJE-ME表现明显的细胞毒性,转染细胞不能存活;质粒pCJE-cME可导致筛选到表达JEV结构蛋白的稳定细胞系,这种稳定表达JEV结构蛋白的细胞系通过PCR扩增细胞系基因组、ELISA、Western Blot、间接免疫荧光等方法得到鉴定。研究结果表明在C蛋白存在下,乙型脑炎病毒C-prM-E蛋白可以在BHK细胞中稳定表达,为研制JEV新型复制子颗粒疫苗提供了便利工具。
- 刘珊黄莺杨鹏孙志伟俞炜源
- 关键词：乙型脑炎病毒结构蛋白细胞系
- 日本脑炎病毒SA14-14-2E蛋白结构域Ⅲ的抗原性和免疫原性分析被引量：3
- 2009年
- 为了表达日本脑炎病毒囊膜蛋白(E蛋白)结构域DⅢ区,了解其作为亚单位疫苗的可能性,本研究根据SA14-14-2病毒株序列(GenBank Accession No.D90195)设计两条引物,以全长JEV感染性克隆pBR-JTF为模板,通过PCR扩增出JEVE蛋白DⅢ的cDNA片段,构建了原核表达载体pET-JEDⅢ,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行融合表达。融合蛋白为可溶性表达,表达量约占菌体蛋白的75%。用纯化后蛋白免疫新西兰兔和BALB/C鼠,通过ELISA,Western blotting,噬斑减少实验,及乳鼠攻毒实验验证JEDⅢ的抗原性和免疫原性。Western blotting及ELISA结果表明纯化后的表达产物具有良好的抗原性,纯化的JEDⅢ蛋白免疫新西兰兔,可以获得高达1:7×105滴度的抗JEV特异性抗体;JEDⅢ蛋白免疫BALB/C鼠,可以获得1:8.2×104滴度的抗JEV特异性抗体。并且获得1:256滴度的中和抗体,乳鼠攻毒实验能达到75%的保护效果。以上结果说明本研究表达、纯化的重组JEDⅢ蛋白,免疫小鼠以及兔后,能产生抗JEV的特异性抗体,中和性抗体,能够保护部分乳鼠接受毒种的攻击,抗原性及免疫原性较好,有进一步开发研制成亚单位疫苗的潜能。
- 黄莺刘珊杨鹏杜韫孙志伟俞炜源
- 关键词：日本脑炎病毒E蛋白亚单位疫苗
- 重组黄热病毒E蛋白结构域Ⅲ作为亚单位疫苗的抗原性和免疫原性被引量：2
- 2009年
- 目的:表达纯化黄热病毒(YFV)囊膜蛋白(E蛋白)结构域Ⅲ,研究其作为亚单位疫苗预防YFV、日本脑炎病毒(JEV)感染的可能。方法:扩增YFVE蛋白结构域Ⅲ(YFDⅢ)的cDNA片段333bp,将其连接到原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-YFDⅢ,转化感受态大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达重组YFDⅢ;用纯化的YFDⅢ免疫新西兰兔和BALB/c鼠,检测相关抗体滴度。结果:在大肠杆菌中可溶性表达了YFDⅢ融合蛋白,表达量约占菌体蛋白的50%;Western印迹及ELISA分析表明,纯化的YFDⅢ具有良好的抗原性和免疫原性;利用纯化的YFDⅢ免疫新西兰兔,获得了高达1∶4×105滴度的抗YFV抗体和1∶2×104滴度的抗JEV抗体;利用纯化的YFDⅢ免疫BALB/c鼠,获得了1∶7×104滴度的抗YFV抗体和1∶2×103滴度的抗JEV抗体。结论:重组YFDⅢ有较好的免疫原性,具有开发成亚单位疫苗的潜能。
- 杨鹏黄莺刘珊孙志伟俞炜源
- 关键词：黄热病毒E蛋白免疫原性抗原性亚单位疫苗
- 一种日本脑炎病毒JEV复制子载体及其应用
- 本发明提供了一种以日本脑炎病毒基因组为骨架的复制子载体，以及用于该复制子载体包装的细胞系及包装系统。本发明JEV复制子载体有高效表达外源蛋白的能力。将复制子载体免疫小鼠，三免后抗JEV抗体滴度达到1∶1280，能保护75...
- 黄莺刘珊杨鹏孙志伟俞炜源
- 文献传递
- 日本脑炎病毒SA14-14-2株基于DNA的感染性克隆、其构建方法及应用
- 本发明涉及日本脑炎病毒SA14-14-2株基于DNA的感染性克隆及其构建方法，所述感染性克隆以pBR322质粒为骨架载体，通过插入日本脑炎病毒SA14-14-2疫苗株的全长cDNA获得，所述SA14-14-2疫苗株全长c...
- 黄莺贾丽丽孙志伟徐宏山俞炜源俞永新
- 文献传递
- 嵌合病毒技术在黄热病毒属病毒研究中的应用
- 2004年
- 嵌合病毒技术是用于RNA病毒研究的一个重要技术,近十年来在黄热病毒属病毒的研究中,构建了一些型内及型间的嵌合病毒,不仅有利于该属病毒的分子机制研究,更重要的是研制出一些新型减毒活疫苗。本文简单介绍该技术的原理、构建、影响因素、应用前景等。
- 黄莺俞炜源
- 关键词：嵌合病毒RNA病毒减毒活疫苗
- 流行性乙型脑炎病毒(JEV)全长感染性克隆的制备及恢复病毒的获得被引量：24
- 2003年
- 根据JEV病毒减毒株SA14-14-2基因组序列,设计覆盖全长的4对重叠引物,以提取的活疫苗病毒RNA为模板,RT-PCR扩增出4个片段,并克隆到质粒载体中,进一步构建两个半端分子克隆,然后将全长cDNA序列克隆到一个新改造的低拷贝质粒载体pBR-kpn中,构建我国流行性乙型脑炎病毒(JEV)基因组全长cDNA克隆。经过体外转录后得到的转录子转染BHK-21细胞,重新获得JEV的恢复病毒,通过生物学特性、分子生物学水平、蛋白水平等几个方面对恢复病毒进行鉴定。结果获得了稳定的全长cDNA克隆,转录子转染BHK-21细胞后,第4天开始出现细胞病变(CPE),第6～7天时CPE为 ,经过Vero细胞进一步放大培养后,间接免疫荧光实验和RT-PCR实验均为阳性。证实了构建的JEV的全长cDNA克隆有感染性,为进一步的研究奠定了基础。
- 黄莺贾丽丽孙志伟王志伟俞炜源俞永新
- 关键词：流行性乙型脑炎病毒感染性克隆质粒载体
