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不同复性方法制备的rhBMP-2m诱导异位成骨活性比较被引量：7: 2007年; 目的:用三种不同方法复性重组人骨形成蛋白2成熟肽(rhBMP-2m),比较其异位诱骨活性.方法:将工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达,裂菌收集包涵体后经离子交换色谱分离纯化.纯化后的rhBMP-2m用三种不同方法复性:①对pH4.8复性液透析复性;②对pH9.0复性液稀释复性;③对pH6.5复性液透析复性.不加任何载体,1mg复性后rhBMP-2m直接植入小鼠肌肉观察诱骨生成.结果:得到纯度为98%的rhBMP-2m.①pH4.8透析复性后蛋白可溶.经过滤除菌,可溶性rhBMP-2m没有损失.冻干后植入肌袋,2wk后诱导生成软骨,4wk诱导生成骨小梁.②pH9.0稀释复性后虽然肉眼观察蛋白似为可溶,但经除菌膜过滤rhBMP-2m损失90%以上.冻干后植入肌袋,1wk诱导生成软骨,2wk诱导软骨内成骨,3wk出现骨小梁.③pH6.5透析复性后蛋白不可溶,植入肌袋,2wk诱导生成骨小梁,4wk后出现骨髓样细胞.结论:相比酸性和碱性条件,中性条件下复性的rh-BMP-2m的诱骨活性最好,但酸性条件下复性的rhBMP-2m溶解度好.; 赵玮钦陈苏民王涛张晓楠王丽; 关键词：高密度发酵蛋白质纯化蛋白质复性

重组人骨形成蛋白复性探讨及重组人骨形成蛋白4二连体对辐射损伤小鼠造血系统的作用: 骨形成蛋白/(bone morphogenetic proteins，BMPs/)属于TGF-β超家族成员，研究表明：BMPs不是一般的生长因子，而是一类多功能的细胞分化因子。BMP2和BMP4是骨形成蛋白家族中的两个重...; 赵玮钦; 关键词：蛋白质表达蛋白质复性; 文献传递

rhBMP-2m大规模制备纯化过程中使用尿素的分析被引量：2: 2006年; 为大规模制备rhBMP-2m,将高表达rhBMP-2m的工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达,收集菌体,经裂菌和超声洗涤得到并纯化的包涵体。洗涤后的包涵体中,rhBMP-2m占蛋白量的75．1％。为获得高纯度的rhBMP-2m,采用尿素作变性剂将包涵体溶解,经SP-Sepharose FF柱和Q-Sepharose FF柱两步纯化。rhBMP-2m包涵体经pH6．5尿素溶解后,经SP-Sepharose FF柱纯化,蛋白纯度为91％;若rhBMP-2m在碱性尿素中作用时间超过48 h,再经Q-Sepharose FF柱纯化后,纯化产物中在还原性SDS- PAGE中会出现少量与rhBMP-2m二聚体大小接近的蛋白带,显示出碱性尿素对rhBMP-2m的共价修饰作用,会严重地影响 rhBMP-2m的纯化效果和活性:若24 h内完成分离纯化则影响较小,纯化后rhBMP-2m单体的纯度达98％以上。本研究表明尿素适合rhBMP-2m包涵体的大规模纯化。文章对使用尿素的利弊进行了讨论,提出大规模制备蛋白质时最好避免在碱性环境使用高浓度尿素。; 赵玮钦陈苏民陈南春王涛秦云关露媛张晓楠; 关键词：高密度发酵尿素

hErmin160蛋白的表达及其多克隆抗体的制备被引量：1: 2008年; 目的:对hErmin氨基端160个氨基酸(hErmin160)蛋白进行表达、鉴定和纯化并制备其多克隆抗体,为研究hEr-min功能奠定基础.方法:PCR扩增编码hErmin160的核苷酸序列,克隆入原核表达载体pET41-b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,诱导表达hErmin160融合蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western Blot进行鉴定,经镍柱纯化后,免疫家兔,制备其多克隆抗体,并对免疫后抗血清进行亲和纯化,用Western-Blot检测抗体纯化的效果.结果:测序证实获得hEr-min氨基端前160个氨基酸的编码序列;SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量为51ku,与理论值相符;灰度扫描分析hErmin160融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的10%,纯化产物纯度达92%;Western Blot确认所表达的蛋白;抗血清和纯化后的多克隆抗体WestermBlot反应均为阳性.结论:利用大肠杆菌融合表达系统,获得了较高纯度的可溶形式hErmin160融合蛋白,并通过亲和纯化成功制备hEr-min160多克隆抗体.; 徐清赵玮钦王涛关路媛陈南春张斌; 关键词：原核表达多克隆抗体

Red系统三种蛋白在哺乳动物细胞核中定位表达的设计和构建被引量：3: 2008年; 目的:构建在哺乳动物细胞核中同时定位表达Red系统三种蛋白的载体。方法:通过给red基因(gam、bet和exo)的3,端分别加入由7个氨基(pro-lys-lys-lys-Arg-Lys-val)组成的核定位信号序列(nuclear localization signal,NLS)和4个甘氨酸构成的linker序列,再从λ噬菌体基因组中,通过PCR技术分别扩增到C端均都带有NLS的gam、bet和exo的DNA全长序列,将三种PCR产物依次克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,得到含3个目的基因(gam-NLS、bet-NLs和exo-NLS)的三顺反子表达载体pCMV-gNIbNIxN,转染培养的哺乳类细胞后,用作者制备并纯化的抗Red3种蛋白的抗体进行间接免疫荧光检测,观察蛋白的定位情况。结果:不带有NLS的Red3种蛋白在细胞中表达主要集中在细胞质很少进入细胞核;而带有NLS的Red3种蛋白于不同时间转染人和鼠的两种细胞后,均表达定位于细胞核中。结论:三顺反子表达载体pCMV-gNIbNIxN的成功构建为进一步探索将λ噬菌体的red系统用于哺乳动物细胞的基因替代打下基础。; 张晓楠黄勇曹蔚侯颖赵玮钦关璐媛陈苏民吴元明; 关键词：核定位信号蛋白质表达

影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨被引量：5: 2008年; 目的探讨影响大肠杆菌DH5a电转化效率的几个关键但易被忽略的因素。方法于室温(25℃)用空气浴振荡和水浴振荡培养大肠杆菌DH5a,用10%(V/V)甘油-水溶液和10%(V/V)甘油-生理盐水溶液冻存所制感受态细胞。在电压2.5kV、电阻200Ω、电容25μF的条件下进行电转化,电击冰浴(0～10min)后测定转化效率。结果于25℃水浴振荡培养细菌、10%甘油-生理盐水溶液冻存感受态细胞、电转化后冰浴6min,转化效率高达1.01×1010CFU/μg DNA。结论该法适合于大肠杆菌DH5a,可获得较高的转化效率。; 张晓楠肖玉黄勇张秀敏王涛王丽关璐媛赵玮钦; 关键词：感受态细胞电穿孔

DPP-rhBMP-4m融合表达载体的构建和应用被引量：3: 2007年; 目的:构建容易去除标签蛋白的大肠杆菌融合蛋白表达载体.方法:PCR方法获得带有Asp-Pro-Pro前缀的重组人骨形态发生蛋白-4成熟肽(recombination human bone morphogenetic protein 4 mature peptide,rhBMP-4m)编码序列并克隆入pRSET载体,转化大肠杆菌后诱导表达;经免疫印迹法鉴定融合蛋白;甲酸裂解去除6His标签后细胞学实验检测其活性.结果:构建的融合表达载体序列测定结果与预期结果一致;诱导表达的DPP-rhBMP-4m融合蛋白以包涵体形式存在,占菌体总蛋白量的37%,亲和层析后目的蛋白纯度为97%;免疫印迹法鉴定显示,该融合蛋白可与相应抗血清产生特异性反应;对C2C12细胞具有良好的生物活性.结论:成功构建了利于目的蛋白纯化的pRSET-DPP-rhBMP-4m融合表达载体.; 王丽陈苏民陈南春张晓楠赵玮钦黄勇王涛关路媛; 关键词：纯化

rhBMP-2m在高浓度条件下的复性被引量：1: 2008年; 目的:优化高浓度的人骨形成蛋白2成熟肽(rh-BMP-2m)的复性条件.方法:将工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达,裂菌收集包涵体后经离子交换色谱分离纯化.纯化后的蛋白在不同的温度、复性液pH,氧化交换系统浓度、盐浓度等条件下进行透析复性.透析复性后进行非还原的SDS-PAGE,检测rhBMP-2m活性形式二聚体的含量,同时找出相对较优的复性方法对复性产物进行0.22μm微孔滤膜除菌并计算其损失率.结果:经透析复性后rhBMP-2m完全可溶,而且其活性形式二聚体的含量达到30%左右,即复性后二聚体的rhBMP-2m可以达到每升发酵液800 mg,并且经微孔滤膜除菌后rhBMP-2m活性形式二聚体的含量基本没有损失,同时蛋白定量也表明过滤除菌后蛋白损失不超过10%.结论:高pH有利于rhBMP-2m的复性,除变性剂尿素时采用低pH可以保持高浓度rhBMP-2m复性后仍保持可溶.蛋白质的浓度、pH和温度对蛋白复性的结果影响很大,但盐浓度、氧化交换系统的浓度和透析外液体积对蛋白复性影响不是很大.; 王馥丽陈苏民陈南春赵玮钦; 关键词：蛋白质复性

基因重组人骨形成蛋白4成熟肽在大肠杆菌中的大规模发酵表达及纯化被引量：3: 2005年; 含有编码人骨形成蛋白4成熟肽(Bone morphogenetic protein 4 mature peptide,hBMP-4m)cDNA表达质粒的菌株,经50代传代,质粒不丢失,仍然稳定高表达hBMP-4m。将此菌株导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵、诱导表达,测定发酵菌液OD600值为43.5,离心收集菌体,PAGE电泳结果hBMP-4m占细菌总蛋白量的39％。悬浮所收集的菌体、裂菌,洗涤后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的85％。将少量包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解分别上SP阳离子和Q阴离子交换柱,用连续盐浓度的洗脱液洗脱蛋白,收集各蛋白峰做蛋白电泳分析,找到洗脱液的最合适盐浓度。然后将全部包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解,上阳离子交换柱SP柱,以最佳盐浓度洗脱液洗脱,获得纯度为91％的hBMP-4m。再上阴离子交换柱Q柱,最佳盐浓度洗脱液洗脱后,所得hBMP-4m纯度为98％。; 秦云陈苏民关路媛陈南春赵玮钦宋庆贺; 关键词：蛋白质表达蛋白质纯化

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赵玮钦

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