徐影琪
- 作品数：9 被引量：4H指数：1
- 供职机构：中国医科大学更多>>
- 发文基金：辽宁省科学技术计划项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学生物学更多>>
- pcDNA3.1/myc-His-DJ-1^(M26I)重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究被引量：3
- 2012年
- 目的构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础。方法采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测。结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P<0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P<0.05)。结论成功构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1 M26I的NIH3T3细胞。DJ-1 M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡。
- 张梅英徐影琪王惟赵越杨葳于萌郭晓冲秦英郑志红
- 关键词：DJ-1NIH3T3细胞凋亡
- 一种能实现蛋白可逆表达的敲入载体构建方法被引量：1
- 2016年
- 在细胞或小鼠中使用Cre重组酶(Cyclization Recombination Enzyme,即环化重组酶)条件性地删除或修饰基因是不可逆的,基因删除后蛋白不能恢复表达。FK506-雷怕霉素结合蛋白FKBP L106P不稳定结构域(FKBP L106P destabilization domain)DD-C-Shield1系统可以解决这个问题,能人为控制蛋白表达或降解,避免胚胎致死。本实验以小GTP酶腺苷二磷酸核糖基化因子6(ADP-ribosylation factor 6,ARF6)为例,借助EL350细菌中Red/ET重组作用,使用DD-C-Shield1系统和重叠延伸PCR方法,发展一种通用的可实现蛋白可逆表达的构建敲入载体的方法。该方法缩短了构建时间,减少了重组的步骤,不需要使用rps L-neo DNA、链霉素和酶切位点。此敲入载体两侧同源臂5 kb左右,可用传统的ES打靶方法构建敲入小鼠,经过简单改造也可使用CRISPR/Cas9方法构建敲入细胞或小鼠模型,从而在细胞和动物模型中进行条件性修饰、快速、可逆地调节特异性蛋白表达,以利于发育学研究,为细胞和活体生物严谨调控蛋白功能提供了一种新的策略。
- 王金霞徐影琪魏政立杨葳张梅英郑志红
- 关键词：重叠延伸PCR
- 应用Talen法制备apoE基因敲除大鼠模型
- 2015年
- 目的应用转录激活因子样效应因子核酸酶（Talen）法制备载脂蛋白E（apoE）基因敲除大鼠模型，为进一步研究apoE基因功能，动脉粥样硬化（AS）疾病发病机制及治疗方法奠定基础。方法设计并合成针对大鼠apoE基因的Talen序列，应用原核显微注射方法制备子代鼠。通过PCR．测序及TA克隆-测序法检测仔鼠中apoE的突变，经传代及兄妹交配获得纯合型仔鼠，并对其基因型进行鉴定。应用Westemblot方法检测apoE-/-仔鼠各组织中ApoE蛋白表达水平；血清学分析血脂总胆固醇（CHO）及甘油三酯（TG）含量；应用RT—PCR方法检测脂质代谢相关基因三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）的表达。结果经鉴定选取在第二外显子处缺失1bp，造成开放阅读框移码突变的大鼠为阳性F0代仔鼠，该鼠经传代及筛选，最终获得apoE-/-大鼠。Westernblot检测显示apoE-/-鼠在心、肝、肾、脑、卵巢组织中未见ApoE蛋白的表达，表明在该模型中成功实现了apoE基因的敲除。apoE-/-鼠血脂CHO、TG均高于野生SD大鼠，其中CHO水平呈现显著性差异（P〈0．05）。在apoE-/-鼠肝组织中ABCA1的表达降低，可能起到促进AS形成的作用。结论应用Talen法成功制备apoE基因敲除SD大鼠；经筛选获得了纯合型apoE-/-大鼠，该模型实现了apoE基因敲除，并表现为高血脂及As性状。
- 徐影琪李晓晶杨葳周生来于洋王惟张婀娜赵文张梅英郭大勇王宏宇郑志红
- pcDNA3．1／myc-His-DJ-1^M26I真核表达载体构建及其在NIH3T3细胞中表达
- 2012年
- 目的构建pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc-his-DJ-1^M26I重组表达载体，为进一步研究DJ-1^M26I基因的功能及建立转基因动物模型奠定基础。方法采用突变试剂盒将第26位氨基酸进行突变，分别构建pcDNA3．1／myc-his—DJ-1和pcDNA3．1／myc-his-DJ-1^M26I重组表达载体，采用脂质体转染的方法分别将pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc—his-DJ-1^M26I质粒转染NIH3T3细胞并用G418压力筛选稳定克隆，对获得的2种转染细胞在DNA水平、转录水平和蛋白质水平鉴定。结果pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc-his—DJ-1^M26I质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后，经PCR检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆，RT-PCR及western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测，结果均证明外源插入基因的表达，MTT实验结果初步证明转染DJ-1^M26I基因的NIH3T3阳性细胞组增殖速率低于正常NIH3T3细胞组（P〈0．05）。结论成功构建pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc-his-DJ-1^M26I重组表达质载体。
- 张梅英王惟徐影琪赵越杨葳于萌郭晓冲秦英郑志红
- 关键词：DJ-1NIH3T3细胞帕金森氏病
- MicroRNA簇剔除胚胎干细胞的研究
- 目的 为了探讨microRNA 簇的生物学意义，建立microRNA 簇剔除胚胎干细胞模型。方法 运用生物信息学手段，确定6 个microRNA 簇基因组的序列，设计基因剔除策略，构建基因剔除载体，以电穿孔方法将基因剔除...
- 王金霞徐影琪王惟杨葳董婉维刘佳李兆阳张梅英郑志红
- 关键词：基因敲除胚胎干细胞SOUTHERNBLOT
- 正反向Penetratin转导肽细胞穿膜效率的初步比较
- 2013年
- 目的:实验致力于研究正反向细胞穿膜肽Penetratin携带工具的穿膜效率,为进一步解决大分子药物的临床应用奠定基础。方法:通过质粒构建重组成融合质粒载体pET-28a-EGFP,pET-28a-Penetratin(+)-EGFP和pET-28a-Penetratin(-)-EGFP,分别在BL21(DE3)中进行表达、经过His标签蛋白纯化柱纯化,得到比较纯的融合蛋白,然后用这些蛋白与HeLa细胞共同孵育,进行蛋白质的穿细胞功能检测。结果:His-Penetratin(+)-EGFP和His-Penetratin(-)-EGFP穿细胞膜能力类似,而His-EGFP不具有细胞穿膜功能。结论:经过研究验证正向和反向序列Penetratin穿膜能力类似,并且两种融合蛋白穿膜机制与膜受体无关,属于被动运输的一种,两种融合蛋白对细胞无创伤作用,为开发新药成功建立了技术平台。
- 郭庆国徐影琪叶翠
- 关键词：质粒构建绿色荧光蛋白
- DJ-1^(L166P)与DJ-1^(M26I)基因对NIH3T3细胞增殖和凋亡的比较
- 2012年
- 目的在细胞学水平比较DJ、DJ-1M26 I、DJ-1L166 P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础。方法分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166 P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26 I重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测。结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166 P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26 I重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166 P和DJ-1M26 I组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组(P<0.05),转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞(P<0.05)。结论 DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的。
- 张梅英任萍萍徐影琪王惟赵越杨葳于萌郭晓冲秦英郑志红
- 关键词：DJ-1NIH3T3细胞帕金森凋亡
- 胃癌细胞MGC803中miR-200a作用机制的初步研究
- 前言
胃癌是源自胃粘膜上皮的恶性肿瘤,在我国发病率及死亡率很高。胃癌涉及到多种癌基因的激活及抑癌基因的失活,揭示这些基因变化的规律,不仅可以阐明癌变的机制,更可以协助肿瘤的诊断、治疗和预后。近年来,miRNA分子对...
- 徐影琪
- 关键词：胃癌E-CADHERIN表达
- 文献传递
- PCDNA3.1/MYC-HIS-DJ-1M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究
- 目的 构建PCDNA3.1/MYC-HIS-DJ-1和PCDNA3.1/MYC-HIS-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将D...
- 张梅英徐影琪王惟赵越杨葳于萌郭晓冲秦英郑志红
- 关键词：DJ-1NIH3T3细胞
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