- BCR/ABL癌蛋白片段的表达、纯化及其抗血清的制备被引量：3
- 2001年
- 目的 克隆并表达 bcr/ abl融合基因片段 ,并制备其抗血清 .方法 PCR扩增包含蛋白融合点的 bcr/ abl癌基因片段 ,序列测定后克隆入带有 His标签的原核表达载体 p ET-16 b,转化宿主菌 BL2 1,IPTG诱导表达 ,SDS- PAGE分析表达结果 ,Ni- NTA树脂亲和纯化 ,皮下多点注射免疫小鼠 ,EL ISA确认抗血清的滴度 .结果 PCR扩增得到大小约 5 2 3bp的目的片段 ,序列测定表明与发表序列完全一致 ;得到了一种新的癌基因 bcr/ abl片段的原核表达载体 p ET- 16 b- bcr/abl,在 BL 2 1中表达可见于 Mr 2 1× 10 3处有一蛋白新生带 ,表达的 BCR/ ABL蛋白免疫小鼠后 ,EL ESA确认抗血清的滴度 >1∶ 2 0 0 0 .结论 成功的克隆、表达了 bcr/ abl融合基因片段 ,并制备了相应的抗血清 .
- 梁英民蒋姗姗孙强吴绒丽陈萍李荣周鹏王键韩骅
- 关键词：BCR/ABL融合蛋白抗血清慢性粒细胞白血病
- LIM结构域蛋白KyoT相互作用分子的筛选被引量：6
- 2002年
- KyoT为LIM结构域蛋白 ,可与转录因子RBP Jk相互作用。为了研究其功能 ,用酵母双杂交法筛选了与KyoT相互作用的蛋白。以KyoT2为诱饵筛选人淋巴结cDNA文库 ,从 5× 10 6 个克隆中共获得 4 2个阳性克隆。提取质粒进行酶切鉴定 ,获得 2 2个非重复克隆。对此 2 2个克隆进行序列分析 ,共获得 13种基因 ,其中包括已知的KyoT相互作用蛋白RBP Jk和两个未知基因。另一种被筛选到的已知基因是激活状态的信号转导物和转录因子 1活化物的抑制蛋白 (proteininhibitorofactivatedsignaltransducerandactivatoroftranscription 1,PIAS1)。由于KyoT在小鼠睾丸中表达较高 ,因此进一步探讨了KyoT2与PIAS1的相互作用。并首先在酵母中证实KyoT2与PIAS1的相互作用并得到阳性结果。进而在大肠杆菌中表达纯化了KyoT2蛋白 ,并以此为抗原制备了抗KyoT2多克隆抗体 ,再用GST pulldown实验验证了KyoT2和PIAS1在体外的相互作用。成功筛选了KyoT相互作用蛋白 ,发现并验证了KyoT与PIAS1的相互作用 。
- 李荣王冀姝孙强王键杨曦黄红燕周鹏韩骅
- 关键词：LIM蛋白酵母双杂交转录
- 核糖体蛋白RpL6/Taxreb107核定位信号的确定及启动子分析
- 利用核定位信号捕捉系统确定核糖体蛋白L6(RpL6)的核定位信号(NLS)的位置，并在体外培养的细胞中加以证实.氨基端的30-41和68-84氨基酸残基具有核定位及核仁定位功能.RpL6又称Taxreb107，是HTLV...
- 王冀姝杨曦李荣孙强周鹏韩骅
- 关键词：核糖体蛋白核定位信号启动子转录因子
- 文献传递
- 带有蛋白转导结构域的Bcr/Abl癌蛋白片段的表达及其跨膜转运被引量：10
- 2001年
- HIV 1编码的反式激活蛋白TAT具有将细胞外蛋白转导进入细胞的基序 ,称为蛋白转导结构域 (PTD) .为研究PTD介导的PTD Bcr Abl融合蛋白的跨膜转运 ,合成了编码PTD的基因片段 ,并与PCR扩增的慢性粒细胞白血病癌蛋白bcr abl基因片段融合 .在大肠杆菌中表达纯化了融合蛋白 ,将纯化的融合蛋白加入培养的HL60细胞和C2C12细胞后 ,发现PTD基序可以介导Bcr Abl蛋白自由从细胞外跨膜转导进入细胞内 .研究结果可能为用外源蛋白负载 (loading)免疫活性细胞如抗原提呈细胞提供新的途径 .
- 梁英民孙强蒋姗姗陈萍王冀姝李荣周鹏王键黄红艳韩骅
- 关键词：蛋白转导结构域BCR/ABL慢性粒细胞白血病癌蛋白
- LIM结构域蛋白KyoT基因剔除小鼠的建立和表型分析被引量：2
- 2001年
- KyoT为一LIM结构域蛋白,可与转录因子RBP-Jk相互作用而调节其转录活性.构建了KyoT基因剔除载体,转染小鼠胚胎干细胞(ES细胞)后得到同源重组的ES细胞克隆.将此ES细胞注射入小鼠的囊胚泡得到嵌合小鼠,再经小鼠培育得到KyoT基因被剔除的小鼠.纯合子KyoT基因剔除小鼠不能表达有功能的KyoT蛋白.表型分析表明纯合子KyoT基因剔除小鼠腹腔B1B细胞数增加,提示KyoT可能参与B淋巴细胞的发育.
- 韩骅王冀姝李荣牛利国孙强周鹏
- 关键词：基因剔除B淋巴细胞转录因子DNA结合蛋白
- 核糖体蛋白L6/Taxreb107的核定位信号的分析被引量：2
- 2002年
- 核糖体蛋白L6 (RpL6 ,Taxreb10 7)含有三个具有核定位信号特征的基序 .用作者构建的核定位信号捕获系统分析了这些核定位信号是否具有介导蛋白质进行核转位的功能 .将RpL6 /Taxreb10 7分段插入核定位信号捕获载体的克隆位点后转化宿主酵母 ,发现其前两个核定位信号可以介导融合蛋白进入细胞核 ,而第三个核定位信号无此作用 .将RpL6 /Taxreb10 7分段与绿色荧光蛋白融合后转染培养的哺乳类细胞 ,证实了以上在酵母中所得的结果 .进一步发现RpL6 /Taxreb10 7的前两个核定位信号同时具有核仁定位的功能 .当在细胞中表达的早期 ,进入核内的融合蛋白优先定位于核仁 .这些结果一方面有助于理解RpL6 /Taxreb10 7核转位的机理 ,同时说明作者构建的核定位信号捕获系统也可用在蛋白质中寻找核定位信号 .
- 王冀姝杨曦李荣周鹏张淼丽韩骅
- 关键词：核定位信号核转位绿色荧光蛋白
- 小鼠Notch1胞外段高抗原区编码基因的克隆与表达
- 2002年
- 目的 :克隆小鼠Notch1胞外段高抗原区编码基因 ,并进行原核表达及蛋白纯化 ,为制备mNotch1的单克隆抗体做准备。方法 :计算机分析小鼠Notch1全长 ,PCR扩增其胞外段高抗原区编码基因 ,克隆入载体T -vector进行序列测定 ,然后将测定正确的片段连入GST融合表达载体pGEX - 4T - 1,得到pG -NEF ,转化宿主菌DH5α ,经IPTG诱导 ,SDS -PAGE分析 ,以及新生条带表达形式分析以后 ,用GST亲和层析柱纯化。结果 :小鼠Notch1分子胞外段近膜处约 170个氨基酸区域抗原性较高 ,PCR扩增得到大小约 5 0 0bp的特异性片段 ,序列测定结果与文献报导的完全一致 ;原核表达产物大小约Mr 43× 10 3 ,以包涵体形式存在 ,约占总蛋白的2 5 % ,纯化后目的蛋白含量 >95 %。结论 :成功地进行了小鼠Notch1胞外段高抗原区编码基因的基因克隆、原核表达及蛋白纯化。
- 黄红艳柳天平孙强张蓉陈萍周鹏王冀姝李荣韩骅
- 关键词：NOTCH1基因克隆原核表达蛋白纯化
- 信号肽捕获系统的建立被引量：9
- 2001年
- 细胞分泌性蛋白的分泌有赖于蛋白质Ｎ端的信号肽的存在。利用酵母建立了从ｃＤＮＡ文库中筛选编码信号肽的基因片段的遗传系统。为此，用一步基因破坏法对酿酒酵母ＥＧＹ４８基因组中的ｓｕｃ ２基因（编码酵母蔗糖转换酶）进行了定位突变，获得了无蔗糖转换酶表达的酵母株ＥＧＹ４８－△ ｓｕｃ。将无信号肽的ｓｕｃ ２成熟肽基因克隆于酵母乙醇脱氢酶（ＡＤＨ１）基因启动子下游，得到用于文库筛选的酵母真核表达载体。启动子与成熟肽基因之间为多克隆位点，用于插入待筛选的ｃＤＮＡ文库。用此载体转化酵母ＥＧＹ４８－△ ｓｕｃ，所得克隆可在以葡萄糖为碳源的培养基上生长，但不能在以棉子糖为碳源的培养基上生长；在ｓｕｃ ２成熟肽基因前分别插入ｓｕｃ ２信号肽基因片段或人ＩＬ－２受体α 链信号肽基因片段，然后转染ＥＧＹ４８－△ ｓｕｃ，所得克隆既能在以葡萄糖为碳源的培养基上生长，也能在以棉子糖为碳源的培养基上生长。表明构建的系统可用于筛选插入多克隆位点的ｃＤＮＡ片段是否具有编码信号肽的功能。
- 孙强王冀姝李荣周鹏黄红艳韩骅
- 关键词：同源重组信号肽基因克隆
- LIM蛋白KyoT2与人类紧密连接蛋白2的相互作用被引量：1
- 2002年
- KyoT是一种LIM结构域蛋白 ,是以RBP J为诱饵蛋白通过酵母双杂交系统得到的新分子。KyoT2可以抑制RBP J介导的转录。以KyoT2为诱饵蛋白 ,通过酵母双杂交筛选得到了人类紧密连接蛋白 2 (ZO 2 )的一种新的剪接体ZO 2 i3。序列分析表明 ,新的剪接体有 19个外显子 ,与已发表序列比较 ,见ZO 2 i3分子的激酶后区发生了改变。为排除酵母双杂交实验的假阳性 ,实验首先在酵母中验证KyoT2与ZO 2 i3的体外直接相互作用并得到阳性结果。进而在大肠杆菌中原核表达纯化带有His标签的KyoT2蛋白 ,使用抗His标签的抗体 ,通过GSTpull downassay验证KyoT2与ZO 2 i3的体外直接相互作用 ,也获得阳性结果。并通过酵母实验初步确定了其作用位点 ,即KyoT2通过LIM2结构域与ZO 2 i3相互作用。本实验验证了KyoT2与ZO 2 i3的相互作用 ,并初步确定其相互作用位点 ,对探讨KyoT的功能具有重要意义。
- 黄红艳李荣孙强王健周鹏韩骅张万会
- 关键词：LIM蛋白相互作用
- LIM蛋白KyoT在小鼠胚胎发育中的表达被引量：1
- 2003年
- IM结构域蛋白KyoT可与转录因子RBP J相互作用而修饰Notch信号途径 .以往发现KyoT在成年小鼠肺脏、肾脏和睾丸中有特异性表达 ,为进一步明确KyoT在小鼠胚胎阶段的表达 ,故分析了KyoT在小鼠不同胚胎阶段的表达水平变化和胚胎 17天时各组织的表达分布 .采用RNA印迹发现KyoT在小鼠胚胎的各阶段均表达 ,而且胚胎 17天时表达水平最高 .进一步RNA印迹和免疫组织化学检测发现 ,KyoTmRNA和蛋白质在胚胎17天小鼠的肺、肾以及肌肉中均有高水平的表达 .上述结果提示 ,KyoT在小鼠胚胎发育过程中有特异性表达 ,且在胚胎 17天时KyoT表达器官分布与成年小鼠相似 ,特异性定位于肺、肾和肌肉等脏器 .
- 李荣程轶梦陈蕾胡静孙强黄红艳王键韩骅
- 关键词：小鼠胚胎发育
