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一株海洋细菌Thalassomonas sp. LD5的琼胶酶研究: 琼胶多糖由于分子量大、溶解度小、不易吸收等特点，其应用受到很大限制。而传统的化学酸解多糖制备寡糖的方法存在着反应条件难控制、降解产物不均一等问题，已成为制约琼胶寡糖应用的瓶颈。相反，利用多糖降解酶制备琼胶寡糖，具有高效、...; 刘丹; 关键词：琼胶酶分离纯化酶学性质基因克隆; 文献传递

一株海洋高产壳聚糖酶菌株Renibacterium sp．QD1的筛选鉴定及产酶研究被引量：2: 2013年; 目的:获得高产壳聚糖酶菌株。方法:利用唯一碳源法富集产壳聚糖酶菌株,并利用平板水解圈和酶活力检测进行复筛。利用PCR克隆16S rDNA基因进行种属鉴定。利用SDS-PAGE凝胶原位复性鉴定野生菌株产壳聚糖酶的数量和大小。利用单一变量法进行发酵条件的初步优化。结果:获得了一株高产壳聚糖酶菌株,对该菌株的16S rDNA序列进行比对和分析发现该菌株属于Renibacterium属,将该菌命名为Renibacterium sp.QD1。SDS-PAGE电泳和凝胶原位复性结果显示,该菌株能产生一种胞外壳聚糖酶,分子量大小在25ku左右。对其发酵条件进行初步优化,用成分为壳聚糖(0.50%)、KH2PO4(0.10%)、K2HPO4(0.20%)、MgSO4(0.07%)、NaC(l0.10%)、CaCl2(0.01%)、酵母粉(0.05%)、马铃薯浸粉(%)、蛋白胨(0.2%)的培养基发酵,其粗酶活力可达400U/mL,比文献报道的活力最高的Microbacterium sp.OU01高近4倍。结论:获得了一株高产壳聚糖酶菌株,该菌株的发现为壳寡糖的制备提供了新的工具。; 邢培川刘丹于文功路新枝; 关键词：壳聚糖酶

利用Site-Finding PCR克隆琼胶酶基因被引量：4: 2013年; 目的:新型琼胶酶基因的筛选。方法:根据α-琼胶酶基因序列的同源性,设计了兼并引物,利用兼并PCR对所筛选到的琼胶酶产生菌株进行筛选,阳性菌株进行16s rDNA序列测定并构建了进化树。利用染色体步移技术Site-finding PCR获得目的基因的上下游序列,经过拼接获得全长的目的基因序列,并利用Blast对其进行分析。将目的基因插入pET 24a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用平板水解圈初步鉴定了重组酶的性质,并利用DNS法检测了重组酶发酵上清液的酶活。结果:获得了一株疑似α-琼胶酶产生菌株,16s rDNA序列鉴定显示为Thalassomonas sp.,命名为Thalassomonas sp.LD5。获得了一个新的基因,命名为agaD。agaD开放阅读框长4401 bp,编码1466个氨基酸,理论分子量为158.8kDa。序列分析表明,agaD编码的蛋白AgaD与已有的两种α-琼胶酶的相似性分别为89%和77%。重组AgaD经诱导后可以直接降解琼胶平板产生水解圈,其发酵上清液酶活为0.2 U.ml-1,说明该蛋白为琼胶酶。结论:采用分子克隆技术分离出新的琼胶酶基因,该基因的发现为活性寡糖的制备提供了新的工具。; 刘丹邢培川于文功路新枝

琼胶酶AgaD在大肠杆菌中的高效表达被引量：3: 2015年; 【目的】构建琼胶酶Aga D的高效表达体系,优化发酵条件提高重组酶的表达量。【方法】首先根据大肠杆菌(E.coli)密码子偏好性,优化并合成Aga D的基因,使其适合E.coli表达系统;考察了不同的E.coli表达宿主;根据N端法则构建了突变体;评价了培养基中添加Ca Cl2和甘氨酸(Gly)对重组酶表达的影响。【结果】成功构建了琼胶酶Aga D的高效表达体系,确定了E.coli AD494(DE3)为最适表达宿主;利用N端法则提高了重组酶的稳定性,缩短了发酵时间;通过在培养基中添加Ca Cl2和甘氨酸(Gly)进一步提高了胞外酶产量。最终,发酵上清中重组酶的活力由20 U/L提高至11300 U/L,比优化前提高了500余倍。【结论】构建了琼胶酶Aga D的高效表达体系,为GH96家族琼胶酶的深入研究奠定了基础。; 刘欢张伟宾刘丹于文功路新枝; 关键词：琼胶酶密码子优化

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刘丹