曹思
- 作品数：19 被引量：41H指数：4
- 供职机构：黑龙江八一农垦大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金黑龙江省自然科学基金“十二五”国家科技计划农村领域更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学更多>>
- 牛轮状病毒VP6蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备被引量：4
- 2016年
- 目的原核表达牛轮状病毒(rotavirus,RV)VP6蛋白,并制备其多克隆抗体。方法根据Gen Bank中登录的牛RV UK株VP6基因序列(X53667.1)设计一对特异性引物,RT-PCR扩增牛RV UK株VP6全长编码区片段,克隆至载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a-Bo-RV-VP6,转染至E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。将重组蛋白与弗氏佐剂混合后免疫豚鼠,共免疫3次,每次间隔2周,末次免疫后2周,经心脏采血,分离血清,制备VP6多克隆抗体,Western blot法检测其与牛RV的反应原性。结果经双酶切和测序鉴定,重组表达质粒p ET-28a-Bo-RV-VP6构建正确。重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物分别为43 000、34 000、27 000和15 000 4种不同相对分子质量的重组蛋白,纯化后纯度可达95%以上,可与牛RV阳性血清发生特异性反应。制备的VP6蛋白多克隆抗体效价>1∶7 000,且可识别RV天然VP6蛋白。结论原核表达了牛RV VP6蛋白,并制备了抗VP6多克隆抗体,为后续RV疫苗效力评价及RV侵入机理等方面的研究奠定了基础。
- 冉旭华曹思刘阳阳张玲玲张峣倪宏波闻晓波
- 关键词：牛轮状病毒VP6基因原核细胞基因表达多克隆抗体
- G6P[5]型牛轮状病毒的分离鉴定被引量：17
- 2016年
- 轮状病毒(Rotavirus,RV)是全世界范围内引发多种幼龄动物及婴幼儿病毒性腹泻的最主要病原之一,给畜牧业发展和人类健康造成严重危害。通过RT-PCR对来自宁夏犊牛腹泻粪样进行检测,选取阳性样品经MA104细胞进行病毒分离。细胞盲传4代后出现CPE,至7代后细胞CPE现象明显,获得1株牛轮状病毒,扩增VP7、VP4基因并测序分析,结果表明该分离株属于G6P[5]型轮状病毒,命名为NX28。研究明确了G6P[5]型在国内牛群中的存在及流行,并为下一步的牛轮状病毒的分子流行病学研究奠定基础。
- 闻晓波张玲玲倪宏波刘阳阳曹思冉旭华
- 关键词：轮状病毒基因型
- 细胞网格蛋白和内体酸化对轮状病毒侵入的影响
- 轮状病毒(Rotavirus,RV)引起的疾病是一种人畜共患传染病,主要感染5岁以下儿童及幼龄动物,以脱水性胃肠炎为特征,严重时可导致死亡。轮状病毒造成了巨大的社会负担及经济损失,但轮状病毒的治疗尚无特效药。当前两个商品...
- 曹思
- 关键词：轮状病毒多克隆抗体VP6基因
- 文献传递
- C基因型牛副流感3型病毒的分离鉴定被引量：6
- 2016年
- 为了对宁夏地区患有呼吸系统疾病的舍饲牛进行病原鉴定,试验主要利用RT-PCR方法对样品进行牛副流感3型病毒(BPIV3)M基因序列扩增,将扩增产物连接在pMD18-T载体后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行亚克隆。通过氨苄青霉素平板筛选,将鉴定为阳性的克隆菌进行核苷酸序列测定并利用分子生物学软件与GenBank上参考序列进行同源性比对。测序结果表明,从样品中分离到了1株BPIV3,并命名为NX49,其M基因全长为1 056bp;进化分析表明,NX49隶属于BPIV3C基因型,其M基因与中国山东C型分离株SD0835具有较高同源性,核苷酸同源性为99.4%;理化分析表明,该毒株对温度、酸及有机物均敏感,高温孵育下Mg2+对该病毒无保护力;血凝试验表明,NX49对豚鼠红细胞凝集效价仅为1∶4,且仅在4℃孵育时出现凝集反应。本研究成功分离得到一株BPIV3C型毒株,这将有助于中国BPIV3分子进化规律及病毒流行特点的进一步研究。
- 冉旭华张峣曹思卢元赫张玲玲刘阳阳倪宏波朱战波闻晓波
- 关键词：C基因型
- C基因型牛副流感3型病毒分离株全基因组测序及分析被引量：2
- 2016年
- 目的对宁夏地区分离得到的1株C基因型牛副流感3型病毒(bovine parainfluenza 3 virus,BPIV3)进行全基因组测序,并进行同源性及进化树分析。方法参考Gen Bank上登录的BPIV3中国分离株SD0835基因组序列设计5对引物,覆盖病毒基因组全长,提取BPIV3总RNA,以其为模板,进行RT-PCR扩增,扩增产物与p MD誖18-T Vector连接,连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,将阳性克隆进行核苷酸测序,测序结果通过分子生物学软件进行拼接,并与Gen Bank上登录的参考序列进行比较,构建系统进化树。结果成功分离得到1株BPIV3,命名为NX49,NX49株全基因组核酸序列为15 474 nt,提交至Gen Bank的序列号为KT071671。NX49与中国山东C型分离株SD0835的同源性最高,为99.3%;与中国内蒙古A型分离株NM09的同源性为82.5%;与澳大利亚B型分离株Q5592的同源性为81.4%。结论 NX49与SD0835同属一个进化分枝,但由于地域及时间上的不同,可能造成它们之间在基因水平上存在差异。
- 冉旭华张峣卢元赫曹思张玲玲刘阳阳倪宏波闻晓波
- 关键词：全基因组C基因型测序
- 猪轮状病毒ΔVP8*亚单位重组蛋白及其应用
- 本发明涉及一种猪轮状病毒ΔVP8*亚单位重组蛋白以及该蛋白的编码基因。本发明还提供了在该重组蛋白中增加破伤风毒素T细胞表位P2后所形成的重组蛋白以及编码基因。本发明的ΔVP8*蛋白为VP8*中第64-223位氨基酸，能有...
- 冉旭华翟军军闻晓波魏晓曼张峣曹思张春山崔玉东
- 文献传递
- 牛轮状病毒拮抗人源宿主细胞RLRs通路关键因子的分析
- 2017年
- 目前以牛轮状病毒为亲本的人-牛重配口服疫苗临床试验保护效果不佳,可能与免疫抑制有关。为了探讨牛轮状病毒对人源宿主RLRs免疫通路的影响,将牛轮状病毒UK株感染Caco-2细胞6 h/12 h/24 h后,检测IRF3、IRF7、RIG-I和MDA5在转录和蛋白水平变化;构建UK-NSP1/NSP1△IRF3质粒分别转染及NSP1分别与IRF3/RIG-I/MDA5共转染293T细胞4 h/8 h/12 h后,western-blot分析IRF3、RIG-I和MDA5蛋白含量变化。结果显示,UK毒株感染组中各基因转录水平均有所上升,RIG-I和MDA5蛋白含量略有上升,IRF3蛋白含量逐渐下降;NSP1转染组中IRF3蛋白含量逐渐下降,RIG-I和MDA5无明显变化;NSP1△IRF3转染组中各蛋白均无明显变化;NSP1共转染组中IRF3含量逐渐下降,另两组含量均逐渐上升。表明,UK株感染后可能激活了人源宿主细胞先天性免疫RLRs通路,但UK-NSP1能够介导人IRF3蛋白降解,而且需要IRF3结合结构域参与,一定程度上拮抗宿主免疫。
- 刘阳阳冉旭华曹思闻晓波
- 关键词：轮状病毒先天性免疫
- 猪轮状病毒重组VP8*蛋白的原核表达及免疫原性分析被引量：5
- 2015年
- 为了分析原核表达的猪轮状病毒（PRV）Gottfried株截短的VP8＊（△VP8＊aa64—223）重组蛋白的免疫原性，通过构建原核表达载体pET-28a—Gotffried—△VP8＊（aa64—223），转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，IPTG诱导表达、经SDS—PAGE和Westernblotting检测，并纯化后，肌肉免疫Balb／c小鼠，证明重组蛋白相对分子质量约25．0kDa，以包涵体和可溶性两种形式存在，纯化的重组蛋白纯度在95％以上，可溶性蛋白产量可达14～15mg·L-1。ELISA方法检测表明该重组蛋白可以诱导高滴度的特异性抗体，证明其具有良好的免疫原性，为进一步研制PRV亚单位疫苗及建立ELISA诊断方法奠定基础。
- 毕艳铎魏晓曼冉旭华曹思张峣张玲玲苗艳闻晓波
- 关键词：猪轮状病毒原核表达
- 轮状病毒UK株NSP1蛋白对人源宿主细胞干扰素调节因子3的影响被引量：2
- 2018年
- 目的探讨轮状病毒UK株NSP1蛋白对人源宿主细胞干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)的影响。方法将UK毒株感染人结肠腺癌细胞Caco-2 6、12、24 h后,通过实时定量PCR和Western blot检测细胞内源性IRF3在转录水平和蛋白水平的变化;构建质粒pCMV-3×FLAG-UK-NSP1和缺失IRF3结合结构域的质粒pCMV-3×FLAG-UK-NSP1△IRF3,分别单独转染及与p EGFP-N3-IRF3质粒共转染293T细胞4、8、12 h后,Western blot分析IRF3蛋白含量的变化。结果 IRF3 m RNA转录水平无明显变化,UK毒株感染组和NSP1质粒转染组IRF3蛋白含量均下降。结论 UK-NSP1能够介导人IRF3蛋白降解,且需要IRF3结合结构域参与。
- 冉旭华刘阳阳曹思张峣闻晓波
- 关键词：干扰素调节因子3免疫抑制
- 破伤风毒素T细胞表位P2对猪轮状病毒△VP8^＊蛋白免疫原性的增强作用被引量：1
- 2016年
- 仔猪轮状病毒腹泻严重危害养猪业，为了开发亚单位疫苗，本课题组前期构建了猪轮状病毒SB-1A株截短的VP8^＊蛋白（△VP8^＊，64～223位氨基酸）原核表达载体pET28a—SB1A△VP8^＊。为了进一步提高亚单位疫苗的免疫原性，将破伤风毒素的通用T细胞表位P2引入重组亚单位蛋白，构建重组载体pET28a—P2-SB-IA△VP8^＊。P2-S13-1A△VP8^＊和S13-1A△VP8^＊在大肠杆菌中表达并纯化。重组蛋白与氢氧化铝佐剂混合后经肌肉注射免疫Balb／c小鼠，利用间接ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体水平。结果显示：P2-S13-1A△VP8^＊和S昏1A△VP8^＊在大肠杆菌中得到了高水平、可溶性表达；重组蛋白P2-SB-1A△VP8^＊诱导的血清抗体水平显著高于SB-1A△VP8^＊，说明P2可以增强SB-1A△VP8^＊的免疫原性，为日后开发猪轮状病毒亚单位疫苗奠定了基础。
- 闻晓波魏晓曼冉旭华曹思张峣倪宏波张玲玲
- 关键词：猪轮状病毒T细胞表位P2
