徐雷
- 作品数：11 被引量：12H指数：2
- 供职机构：西北民族大学生命科学与工程学院更多>>
- 发文基金：长江学者和创新团队发展计划中央高校基本科研业务费专项资金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学更多>>
- 重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子在CHO-K1-SFS细胞中的表达
- 2015年
- 目的构建小鼠碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF,亦称FGF-2)的真核表达质粒,并于无血清悬浮培养的CHO-K1-SFS细胞中进行表达。方法以小鼠垂体组织总RNA为模板,PCR扩增b FGF基因,并克隆至真核表达载体p EGFP-C1,构建重组表达质粒p EGFP-C1-b FGF,经Lipofectamine 2000介导转染无血清悬浮培养的CHO-K1-SFS细胞,荧光显微镜观察CHO-K1-SFS细胞中EGFP的表达情况,普通光学显微镜观察CHO-K1-SFS细胞的生长状况和细胞形态,RT-PCR法检测CHO-K1-SFS细胞中b FGF基因的转录,Western blot法检测CHOK1-SFS细胞中b FGF蛋白的表达。结果重组表达质粒p EGFP-C1-b FGF经双酶切(BglⅡ/SalⅠ)鉴定证明构建正确;重组质粒p EGFP-C1-b FGF转染后24、48、72及96 h的CHO-K1-SFS细胞均可见特异性绿色荧光蛋白表达,重组质粒p EGFP-C1-b FGF转染对CHO-K1-SFS细胞形态和增殖速率不产生影响;p EGFP-C1-b FGF转染组CHO-K1-SFS细胞可扩增出510 bp的目的条带;p EGFP-C1-b FGF转染组可见相对分子质量约44 000的特异性条带,表达产物可与兔抗b FGF多克隆抗体发生特异性结合。结论构建的真核表达质粒p EGFP-C1-b FGF在无血清悬浮培养的CHO-K1-SFS细胞中成功的表达,为进一步实现小鼠b FGF在哺乳动物细胞中的分泌表达及药物开发奠定了基础。
- 李向茸冯若飞包晓婧张海霞谢晶莹徐雷马忠仁
- 关键词：碱性成纤维细胞生长因子真核细胞基因表达
- 白细胞介素-7基因慢病毒表达载体的构建及在CHO-K1细胞中的稳定表达被引量：2
- 2017年
- 目的构建白细胞介素-7(interleukin-7,IL-7)基因慢病毒表达载体,并在CHO-K1细胞中稳定表达,为生产试剂级的IL-7奠定基础。方法参照Gen Bank中公布的人IL-7基因核苷酸序列(J04156.1),人工合成该条基因,亚克隆至表达载体pLV-CMV-EF1-GP上,构建重组慢病毒表达质粒pLV-CMV-EF1-GP-r IL-7,在HEK293T细胞中进行病毒包装,检测病毒滴度后,收获细胞毒液,感染CHO-K1细胞,经嘌呤霉素筛选,获得稳定表达IL-7的CHO-K1-r IL-7细胞。荧光显微镜观察感染细胞绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR法检测IL-7基因m RNA的转录;ELISA法检测IL-7的含量;Western blot法检测IL-7的表达。结果重组慢病毒表达质粒pLV-CMV-EF1-GP-r IL-7经双酶切及测序结果证明构建正确。慢病毒的滴度为3×10~8 TU/ml。慢病毒感染CHO-K1细胞24、48和72 h后,均可见特异性绿色荧光蛋白表达,且随着培养时间的延长,荧光强度明显增强;CHO-K1-r IL-7细胞可扩增出约540 bp的IL-7基因片段;经ELISA检测,样品中IL-7含量为0.6 ng/ml;表达产物主要存在于CHO-K1-r IL-7细胞上清中,且具有良好的反应原性。结论成功构建了IL-7基因慢病毒重组表达质粒,并实现了IL-7在CHO-K1细胞上的稳定表达。
- 李向茸令瑛徐雷包晓婧马玉梅车敏娜张海霞冯若飞
- 关键词：白细胞介素-7慢病毒CHO-K1细胞
- rhIL-7生物信息学分析及原核系统分泌表达
- 2017年
- 通过生物信息学分析并预测hIL7糖基化位点、磷酸化位点、信号肽预测、跨膜蛋白、亲疏水性,构建pGEX-4T-1-hIL-7原核表达载体,转化至大肠杆菌LB21(DE3),优化hIL-7表达条件,利用SDS-PAGE电泳和WesternBlot鉴定重组蛋白.表明hIL-7与猴的同源性一致,是一个含有13个磷酸化位点及3个糖基化位点,具有信号肽的亲水性分泌蛋白.重组载体经DNA测序,显示包含正确的hIL-7编码序列.将pGEX-4T-1-hIL-7重组载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导表达融合蛋白(含GST标签),相对分子量约为43 000 Da,表达形式为包涵体表达.采用单因素方法对诱导时间、诱导温度、IPTG浓度进行考查.在此基础上进行3因素3水平正交实验的统计学优化,得到的最优表达条件为37℃、6 h、IPTG浓度0.5 mmol/L.
- 令瑛徐雷李向茸张海霞马忠仁马忠仁
- 关键词：正交实验
- 膜连蛋白A2基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用被引量：4
- 2015年
- 为建立膜连蛋白A2(AnxA2)基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,根据GenBank中公布的AnxA2基因序列设计并合成引物,经过条件优化,建立了AnxA2SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数R2为0.999;灵敏性好,比普通PCR灵敏100倍。应用建立的方法对随机选取的几种哺乳动物细胞进行检测。结果表明,建立的方法能成功检出不同细胞中AnxA2含量。表明本研究建立的AnxA2SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法灵敏性高,重复性好,可用于AnxA2的检测及定量分析。
- 张海霞马玉梅包晓婧徐雷李向茸谢晶莹马忠仁冯若飞
- 脑心肌炎病毒VP1蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及验证被引量：2
- 2015年
- 为筛选与脑心肌炎病毒VP1蛋白相互作用的靶细胞cDNA文库蛋白,构建VP1蛋白的诱饵载体pDHB1-VP1。扩增EMCV的VP1基因并克隆至pMD18-T载体中,经测序验证正确后定向克隆至酵母双杂交诱饵载体pDHB1。将重组pDHB1-VP1载体进行酶切验证和测序分析,并转化酵母报告菌株NMY51,检测其在酵母细胞中有无表达和自激活作用。结果表明,构建的p DHB1-VP1基因可以在酵母细胞中正确表达,产物大小约66 kD,而且可以与兔抗EMCV血清发生特异性结合,有较好免疫原性。成功构建了诱饵载体pDHB1-VP1,可以在酵母细胞中表达且其对报告基因无自激活作用,可以应用于酵母双杂交筛选试验中。
- 谢晶莹冯若飞徐雷张海霞李向茸侯兰新马忠仁
- 关键词：脑心肌炎病毒VP1蛋白酵母双杂交诱饵蛋白
- CD63基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价被引量：3
- 2016年
- 为建立一种CD63基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为CD63基因的动态检测提供有效的实验手段,根据GenBank中公布的CD63基因序列,设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测CD63基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数r2为0.997;灵敏性及重复性均较高;应用建立的方法对多种种属来源细胞进行检测,能检出不同类型细胞中CD63的含量。结果表明,成功建立了一种快速、准确检测CD63基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法。
- 包晓婧张海霞李琼毅马玉梅令瑛魏嘉李向茸徐雷冯若飞马忠仁
- 关键词：实时荧光定量PCRTAQMAN探针CD63
- IL-7直核表达载体的构建及稳定表达
- 白细胞介素7 (Interleukin-7, IL-7),简称白介素7,是由胸腺基质细胞产生的一种细胞因子,成纤维、胎儿肝、骨髓基质等细胞也均可产生或分泌,在T细胞的生长、存活及分化过程中起着至关重要的作用,且与癌症、H...
- 徐雷
- 关键词：白细胞介素7慢病毒转染
- 文献传递
- 一种细胞因子IL‑7的表达方法
- 本发明提供一种细胞因子IL‑7的表达方法，步骤如下：（1）构建IL‑7重组质粒pcDNA3.1‑IL7；（2）将重组质粒pcDNA3.1‑IL7转染HEK293细胞；（3）将转染后的细胞用含G418的高糖DMEM培养基继...
- 冯若飞马忠仁徐雷李向茸张海霞令瑛
- 文献传递
- 人脑心肌炎病毒免疫球蛋白M捕获酶联免疫吸附试验的建立及初步应用被引量：2
- 2015年
- 目的建立脑心肌炎病毒(EMCV)免疫球蛋白M(IgM)捕获酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,用于感染EMCV血清学早期诊断。方法用抗人IgM(μ链)单抗进行包被,辣根过氧化物酶(HRP)标记的EMCV为酶标抗原,初步建立EMCV IgM捕获ELISA;对建立的方法进行条件优化及特异性、精密性、稳定性等验证。结果建立的EMCV IgM捕获ELISA检测方法抗体包被浓度为1μg/mL,EMCV-HRP工作浓度和反应时间分别为1∶400和45min,封闭液为10%马血清时该法检测效果可达最佳,3批试剂批内及批间变异系数均小于5%,且特异性、精密性及稳定性较好。结论建立的EMCV IgM捕获ELISA法特异、精密且稳定,可用于人感染EMCV的早期检查,为EMCV的诊断奠定基础。
- 张海霞冯若飞王丹徐雷谢晶莹李向茸马忠仁
- 关键词：脑心肌炎病毒酶联免疫吸附试验
- 重组人白细胞介素7在HEK293细胞中稳定分泌表达
- 2017年
- 通过构建人白细胞介素7的重组真核表达载体,转染HEK293细胞,实现IL-7在HEK293细胞中的稳定分泌表达,为生产试剂级的IL-7奠定基础。从质粒p LV-CMV-EF1-GP-r IL-7中扩增人IL-7全长基因,并将其构建于pc DNA3.1真核表达载体上。利用脂质体法将重组质粒转染HEK293细胞,经G418筛选及单克隆,获得稳定分泌表达IL-7的HEK293-r IL-7细胞系。成功构建真核表达质粒pc DNA3.1-r IL-7,并实现IL-7在HEK293细胞上的稳定分泌表达,最终获得了1株表达量较高的细胞株,命名为HEK293-IL7-2G3细胞,培养48 h的细胞上清中IL-7的含量为3.2 ng/m L。为进一步实现人白细胞介素7在哺乳动物细胞中的分泌表达及药物开发奠定基础。
- 李向茸王兴陇令瑛徐雷徐雷李琼毅张海霞冯若飞
- 关键词：白细胞介素7转染绿色荧光蛋白分泌表达
