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结核分枝杆菌IS6110和IS1081微滴数字PCR检测体系的建立和应用: 2018年; 目的建立结核分枝杆菌IS6110和IS1081微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）检测体系，并用于不同类型临床样本的检测。方法常规提取13株结核分枝杆菌和14株非结核分枝杆菌临床分离株DNA，9例结核分枝杆菌阳性肺结核患者和4例其他肺部疾病患者痰DNA，12例结核分枝杆菌阳性肺结核患者和7例健康者血浆DNA。设计合成IS6110和IS1081扩增引物和检测探针，建立ddPCR检测体系。应用该体系检测分枝杆菌、痰和血浆3种DNA样本中靶标拷贝数，进行统计学分析。结果建立了能同时检测IS6110和IS1081的ddPCR体系，该体系检测2个靶标的线性范围分别为0．5～8733和0．2～2893拷贝／μl反应体系。该体系具有较好的重复性（r〉0．95），以非结核分枝杆菌为对照检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异度均为100％。在痰和血浆DNA样本检测中，2个靶标拷贝数在肺结核组均显著高于对照组。结论结核分枝杆菌特异性核酸的ddPCR体系，可用于肺结核患者临床分离株、痰和血浆样本的微量核酸检测，对提高结核病病原学诊断能力有重要意义。; 李自慧吕翎娜杜博平潘丽萍贾红彦孙琦张宗德; 关键词：结核分枝杆菌聚合酶链式反应 IS6110

结核分枝杆菌Rv2352c基因的克隆表达及其抗原活性鉴定被引量：2: 2010年; 目的构建含结核分枝杆菌(M.tb)rv2352c基因原核表达载体,经转化E.coli以表达Rv2352c融合蛋白,并研究其抗原性。方法用PCR扩增M.tb rv2352c基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv2352c重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导Rv2352c蛋白表达。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和结核患者血清Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,制备抗Rv2352c抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA),取兔抗血清与纯化蛋白Rv2352c通过Western blot方法,检测抗体特异性。结果经酶切鉴定和测序分析证实rv2352c原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在45 kD处呈现单一蛋白条带。用重组蛋白Rv2352c免疫接种后可诱导出高滴度的特异性抗体。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv2352c,制备和纯化的Rv2352c融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,为进一步研究结核病的潜在分子标志物奠定基础。; 曹廷明贾红彦古淑香郑晓静李自慧杜凤娇刘洋刘忠泉邢爱英杜博平马玙张宗德; 关键词：细菌蛋白质类重组融合蛋白质类

非结核分枝杆菌的基因组学: 2017年; 非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）广泛存在于自然界如土壤、水、尘埃、鱼、家畜及家禽中，其中约三分之一是引起动物或人NTM病的机会性致病菌，严重时可造成感染宿主死亡。人体经环境或动物感染NTM而患病，水和土壤是重要的传播途径，但人与人之间传播尚未得到证实。; 陈曦李自慧潘丽萍郑晓静杜凤娇黄银霞张宗德; 关键词：非结核分枝杆菌基因组学动物感染 NTM病致病菌机会性

免疫抑制沙鼠源肺孢子菌的分类地位: 2010年; 肺孢子菌能够感染多种哺乳动物的肺脏,并在免疫受抑制的个体引起肺孢子菌肺炎.研究表明,肺孢子菌分离株在系统进化树上分为两大枝,二者所含菌株分别来源于灵长类和啮齿类.基于宿主特异性以及DNA序列和形态学差异,每一分枝内的菌株又可分为不同的种.本研究采用地塞米松免疫抑制法,导致沙鼠(28/35)肺组织感染.对18S,5.8SrRNA和rRNA内转录间隔区基因序列,以及线粒体核糖体大亚基基因的部分序列分析表明,本实验沙鼠源肺孢子菌与啮齿类动物来源的同属一枝,但明显区别于其他啮齿类动物来源的菌株,应考虑是一个独立的菌种.; 冯宪敏魏超君Rodney D.Adam李自慧卢思奇; 关键词：肺孢子菌长爪沙鼠

对氨基水杨酸（PAS）耐药与结核分枝杆菌thyA基因突变的研究被引量：4: 2008年; 目的检测结核分枝杆菌临床分离株对氨基水杨酸（PAS）耐药和胸苷酸合成酶基因（thyA）突变的关系，以探讨结核分枝杆菌PAS耐药的分子机制。方法95株结核分枝杆菌临床分离株中的51株PAS敏感株和44株PAS耐药株的PAS耐药相关基因thyA基因进行PCR扩增，扩增产物纯化后进行序列测定，与结核分枝杆菌标准株H37Rv的野生型岫，A基因序列进行对比，判断这些临床分离株的thyA基因有无突变。结果51株PAS敏感株thyA基因未检出突变。44株PAS耐药株中有16个临床分离株的thyA基因检测到突变，突变检出率为36．4％（16／44）。突变类型包括置换、颠换、插入、缺失，均为单碱基改变或单碱基缺失，其中2株为thyA基因2个位点联合突变。结论结核分枝杆菌tyA基因突变是其产生PAS耐药的重要原因之一。结核分枝杆菌胸苷酸合成酶是PAS作用的重要靶位。; 张宗德赵雁林李自慧贾红艳刘宇红陈曦刘忠泉杜博平古淑香邢爱英马玙; 关键词：胸苷酸合成酶抗药性

结核分枝杆菌休眠菌复苏初期与活跃期的差异表达基因分析被引量：4: 2008年; 目的寻找休眠结核分枝杆菌复苏的关键基因，探讨结核分枝杆菌复苏的机制。方法取7H9培养20天的H37Rv作为对数生长期的活跃结核分枝杆菌，并提取RNA。取一部份对数生长期的H37Rv加入亚甲兰作为无氧标志，37℃密封培养，无氧状态下生长的H37Rv会随着培养基中的氧气耗尽而进入休眠状态，继续无氧培养1个月的陈旧菌即为休眠菌，取休眠菌，加入适量5个复苏因子蛋白质组合，37℃有氧培养三天，提取RNA。用mRNA纯化试剂盒纯化RNA。利用抑制性消减杂交（SSH）技术分析复苏因子蛋白刺激三天的休眠结核分枝杆菌和对数生长期结核分枝杆菌的基因组mRNA的表达差异。并通过基因克隆技术、基因测序和序列分析，寻找差异表达基因。结果我们通过SSH杂交，以活跃结核分枝杆菌cDNA为Tester的正相杂交和以复苏因子蛋白刺激三天的休眠结核分枝杆菌cDNA为Tester的反相杂交的各自Tester高表达或特异性表达的片段都得到了选择性扩增，杂交产物经连接pTA2载体、转化DH5α、蓝白斑筛选，正相获得78个阳性菌落，反相获得46个阳隆菌落。阳性单个菌落经液体LB培养基培养，以菌液为模板，T7、M13为引物，扩增插入片段，能扩增到明显的带，且带大于350pb的为阳性。则正相得到66个阳性扩增带，反相得到39个阳性扩增带。这105个阳性扩增带的菌液经测序分析，将序列完全相同的特异性序列筛选合并，正相获得41个不同的特异性序列，反相获得32个不同的特异性序列。再去掉因消减杂交不完全而使正、反相中都获得的相同序列，则正相有30个特异性序列，反相有21个特异性序列。51个序列通过Genbank检索，因有不同序列检索得到对应同一基因的情况，因此，正相30个特异性序列经检索后对应22个不同的基因，反相21个特异性序列经检索后对应9个不同的基因。在我们的�; 刘忠泉张宗德邢爱英陈曦李自慧古淑香贾红艳杜博平马玙; 关键词：抑制性消减杂交基因表达

结核性与恶性胸腔积液中微小核糖核酸内参基因筛选的初步研究被引量：2: 2021年; 目的探讨应用实时荧光定量PCR检测胸腔积液中微小核糖核酸(miRNA)表达量的适宜内参基因。方法搜集2016年9月至2018年12月在首都医科大学附属北京胸科医院确诊治疗的47例结核性胸膜炎患者和31例并发胸腔积液的癌症患者作为研究对象。采用实时荧光定量PCR(SYBR Green引物法)和熔解曲线法分析所有患者胸腔积液标本中纳入研究的U6、Cel-miR-39、miR-16、miR-20a、miR-192、miR-1268、miR-4281共7个miRNA内参基因的表达量[循环阈值(Ct值)]和引物扩增效率,其中Ct值越低,表示基因表达量越高,越适合用于相对定量检测;引物扩增效率介于90%~110%之间,则可以用于后续胸腔积液中miRNA的检测,而平滑且单峰的熔解曲线则表示扩增产物的特异度良好。通过geNorm软件(M值)、NormFinder软件(稳定值)和BestKeeper软件(标准差和变异系数)来分析各内参基因的稳定性,其中M<1.5、稳定值及标准差和变异系数数值越小,内参基因越稳定。同时,分析标本检测的重复性,以及标本不同处理方法对miRNA检测结果的影响。结果78份标本中,检测miR-1268、Cel-miR-39、miR-16的Ct值较低,分别为19.16±4.40、24.17±0.73、24.52±1.65;扩增效率分别为90%、101%、110%,可以用于后续胸腔积液miRNA检测;且7种内参基因的熔解曲线均平滑且单峰,特异度均较好。geNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析Cel-miR-39的M值、稳定值、标准差和变异系数均为最低(分别为0.994、0.674、0.73和3.02%)。7个内参基因在标本重复检测中的稳定性均较好,且在标本采集后1h、2h、4h及反复冻融2次后的miRNA表达量与采样后立即处理的表达量未见差异。结论Cel-miR-39稳定性好,表达丰度适中,适宜作为实时荧光定量PCR技术定量检测胸腔积液中miRNA表达量的内参基因。; 董静贾红彦孙琦李自慧魏荣荣杜博平邢爱英潘丽萍张宗德; 关键词：结核胸膜微RNAS 生物学标记

长爪沙鼠和新西兰白兔源肺孢子虫ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列的测定与分析被引量：1: 2006年; 目的测定长爪沙鼠及新西兰白兔源肺孢子虫的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列,并与大鼠源肺孢子虫的相应序列进行比较分析。方法用地塞米松免疫抑制法诱导长爪沙鼠和新西兰白兔感染肺孢子虫;制作肺印片进行瑞-姬氏复合染色,通过镜检初步了解感染情况;提取肺孢子虫总DNA,设计合成引物进行PCR扩增;纯化扩增产物后克隆测序;与登录Gen-Bank的大鼠源肺孢子虫相关序列进行比较分析。结果长爪沙鼠源肺孢子虫的ITS1、5.8S rDNA和ITS2基因序列长分别为158、157和172bp,新西兰白兔源肺孢子虫的相应序列分别为129、158和178bp。结论本实验测得的长爪沙鼠及新西兰白兔源肺孢子虫的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列以往未曾报道,此结果为肺孢子虫的遗传学研究提供了新的资料。; 李自慧卢思奇冯宪敏张帆王凤云黄松; 关键词：肺孢子虫

对氨基水杨酸(PAS)耐药与结核分枝杆菌thyA基因突变的研究: 对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid,PAS)是二十世纪四十年代发现的有效抗结核药物之一(Lehmann,1946)。PAS可以加强异烟肼和链霉素的活性．并且广泛用于抗结核化疗的联合方案中(Of...; 张宗德赵雁林贾红艳刘宇红刘忠泉李自慧陈曦邢爱英杜博平古淑香马玙; 文献传递

结核分枝杆菌总RNA提取方法的比较研究: 2012年; 目的鉴于结核分枝杆菌RNA提取难度很大，为了提取到高质量的RNA，探讨两种不同方法提取结核分枝杆菌总RNA，并在实验中对其进行优化。方法收集结核分枝杆菌培养物，分别用甲醇和玻璃粉裂解其细胞壁，然后加入Trizol提取结核分枝杆菌总RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，用Nanodrop2000检测其得率和纯度。结果玻璃粉裂解细胞壁法和甲醇裂解细胞壁法提取的结核分枝杆菌总RNA的获得率分别为6．124±l｜144和13．437±1．76760〈0．01），纯度A260／A280的值分别为1．924±0．039和1．899±0．072（P〉O．01）。结论玻璃粉裂解细胞壁法和甲醇裂解细胞壁法提取的结核分枝杆菌总RNA均未发生明显降解。用甲醇裂解法提取的结核分枝杆菌总RNA的获得率明显高于玻璃粉法，差异具有显著性；方法完整性和纯度均能满足实验需要，无明显差异。; 贾红彦李自慧杜博平邢爱英孙琦张宗德焦媚; 关键词：分枝杆菌结核核糖核酸

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李自慧

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