汪志军
- 作品数：21 被引量：17H指数：3
- 供职机构：上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划河北省自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学更多>>
- 委内瑞拉链霉菌秦岭变种属间接合转移系统的构建及透明颤菌血红蛋白的表达被引量：3
- 2010年
- 【目的】构建委内瑞拉链霉菌秦岭变种属间接合转移系统及透明颤菌血红蛋白的表达。【方法】以链霉菌广泛使用的整合型质粒pSET152和复制型pHZ1358为出发质粒,通过供体大肠杆菌(Escherichia coli)ET12567(pUZ8002)进行属间接合转移委内瑞拉链霉菌秦岭变种。【结果】确定了该变种的最佳接合转移条件;通过SOE-PCR(Splicing by overlap extension PCR)技术构建含PermE和vhb结构基因融合片段的整合型表达载体pJD100,转化ET12567(pUZ8002)后属间接合转移委内瑞拉链霉菌秦岭变种。通过PCR和CO结合差光谱验证了vhb基因在委内瑞拉链霉菌秦岭变种中的整合表达。【结论】本文首次探索了委内瑞拉链霉菌秦岭变种接合转移系统,确定了委内瑞拉链霉菌秦岭变种的最佳接合转移条件,并采用基因工程手段使vhb基因在委内瑞拉链霉菌秦岭变种中获得表达。
- 高峰王斌陈太春汪志军安德荣
- 关键词：VHB基因
- DNA硫修饰提升微生物对于多重极端环境胁迫的适应能力
- DNA磷硫酰化修饰是指在天然DNA骨架上发现的P-O键被P-S键替换的化学修饰，属于首例DNA骨架上的生理修饰.这种修饰由五个基因组成的dnd基因簇(dndA-E)编码的蛋白控制.DNA硫修饰在细菌界广泛存在，在动植物致...
- 许冠鹏杨艳梁晶丹汪志军肖湘
- 卡西霉素生物合成基因簇中调控基因calR1的功能
- 2023年
- 【背景】卡西霉素(calcimycin)是重要的离子载体抗生素,其生物合成基因簇已从教酒链霉菌NRRL3882的基因组DNA中成功克隆,但基因簇内的部分生物合成基因及调控基因的功能有待研究。【目的】研究卡西霉素产生菌教酒链霉菌NRRL3882中编码TylR家族同源转录调控蛋白的calR1基因的功能。【方法】通过PCR-targeting的方法,构建calR1基因敲除突变株及回补菌株,对突变菌株及回补菌株进行发酵,通过HPLC分析其代谢产物。利用荧光定量PCR检测ΔcalR1突变菌株和野生菌株的生物合成基因转录水平。【结果】calR1基因敲除突变株丧失产生卡西霉素的能力,但仍有中间产物噻唑霉素的积累,回补菌株中卡西霉素的产量有一定程度的恢复。RT-qPCR结果表明,卡西霉素合成相关的一些重要基因calC、calG、calU3等基因的表达量明显改变。【结论】TylR家族转录调控基因calR1是卡西霉素生物合成的调控基因。
- 苟丽霞蔡楠刘孟欣汪志军韩铁生
- 关键词：调控基因生物合成
- 沙门氏菌硫修饰基因dptC的克隆表达与分离纯化被引量：1
- 2013年
- 【目的】细菌DNA磷硫酰化修饰是指DNA骨架非磷氧桥上的一个氧被硫取代,该修饰增加了机体的抗氧化作用,其发生受被称为dnd的基因簇控制。沙门氏菌(Salmonella entericaserovar Cerro 87)是具有磷硫酰化修饰现象的细菌之一,其dnd基因簇被命名为dptBCDE。本研究旨在克隆其中的dptC基因,优化dptC表达条件,为进一步研究DptC在DNA磷硫酰化修饰过程中的酶学功能奠定基础。【方法】以沙门氏菌总DNA为模板,设计特异引物、PCR扩增获得dptC基因片段,连接于表达载体pGEX-6P-1的SmaI和XhoI位点之间,构建融合表达载体pJTU3622;将pJTU3622转化大肠杆菌(Escherichia coliDH10B),经氨苄霉素抗性初选及序列测定,获得阳性克隆;提取阳性中pJTU3622再转化大肠杆菌表达宿主[E.coli BL21(DE3)pLysS],获得工程菌株Anxh103;优化表达条件,诱导表达dptC基因;采用GST-Trap柱和kata FPLC纯化系统分离纯化DptC蛋白。【结果】获得沙门氏菌dptC基因表达载体pJTU3622和工程菌株Anxh103;确定dptC最佳诱导表达条件为:诱导温度18℃,诱导时间8-18 h,IPTG诱导浓度0.6 mmol/L,LB培养基中添加50μmol/L Fe2+。【结论】成功克隆了沙门氏菌dptC基因,实现了沙门氏菌dptC基因的高通量表达;表达载体中引入TEV酶切位点,使得很容易切除GST标签,为进一步研究DptC的酶学功能奠定了基础;沙门氏菌DptC发酵体系中添加50μmol/L Fe2+可以提高DptC产量,纯化的DptC显示浅棕色,推测与变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中的同源蛋白蛋白DndC一样,也是一种含4Fe-4S的铁硫蛋白。
- 安贤惠周秀芬汪志军邓子新梁晶丹
- 关键词：SALMONELLAENTERICA基因克隆与表达
- 酿酒酵母表达和纯化功能性的铁载体合成蛋白PchE
- 2021年
- 【目的】利用酿酒酵母表达系统,通过乙醇脱氢酶启动子异源表达细菌源的铁载体合成蛋白PchE,并与来源于枯草芽孢杆菌的泛酰化酶Sfp同宿主共表达,探索真核表达体系表达具有生化活性的细菌源蛋白。【方法】从大肠杆菌BAP 1染色体上扩增sfp基因,将pchE基因及串联的pchE与sfp基因分别构建到酵母-大肠杆菌穿梭质粒pXW55中,各自转化酿酒酵母BJ5464-npgA表达,经过亲和层析和离子交换层析纯化蛋白,利用HPLC检测细菌源与酵母源表达的PchE在体外重构生化反应中的催化活性。【结果】利用酿酒酵母表达系统可以获得高纯度的原核蛋白PchE。真菌源的泛酰化基因NpgA和细菌源的Sfp,均可泛酰化修饰PchE,合成中间产物HPT-Cys。【结论】在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BJ5464-npgA表达系统中,首次证明真菌源的泛酰化基因NpgA和细菌源的Sfp,均可泛酰化修饰细菌源的非核糖体肽合酶。比较酵母和细菌宿主的目标蛋白表达,证明酵母表达的巨大蛋白PchE的纯度更高,非特异性条带减少,推测酵母宿主可能更适合表达纯化功能性的巨型蛋白质。
- 陈璐王嘉良梁晶丹邓子新汪志军
- 关键词：酿酒酵母生化活性
- 卡西霉素生物合成调控基因calR2的功能被引量：3
- 2018年
- 【背景】卡西霉素(Calcimycin)是由教酒链霉菌NRRL3882产生的吡咯聚醚类抗生素,结构独特且具有广泛的生物活性,但其生物合成调控机制尚不清楚。【目的】研究卡西霉素生物合成基因簇上编码LuxR家族同源蛋白的潜在调控基因calR2的功能。【方法】通过PCR-targeting的方法对卡西霉素基因簇上的calR2基因进行中断,HPLC对突变株及回补菌株的代谢产物进行分析。利用荧光定量RT-PCR分析ΔcalR2突变菌株和野生菌株的基因转录水平差异。【结果】calR2基因中断的突变株不能产生卡西霉素,回补菌株则恢复产生卡西霉素的能力。RT-PCR结果表明卡西霉素生物合成的一些重要骨架基因在ΔcalR2突变株中的转录水平明显降低。【结论】LuxR家族转录调控基因calR2在卡西霉素生物合成过程中起正调控作用。
- 盖婧璇韩铁生刘文秀武策汪志军苟丽霞
- 关键词：调控基因生物合成
- Salmonella enteric硫修饰蛋白DptC半胱氨酸定点突变对Dnd表型的影响被引量：1
- 2013年
- 【目的】Salmonella enterica serovar Cerro 87是具有硫修饰现象即Dnd表型的细菌之一,其硫修饰受dptBCDE基因簇控制,将dptBCDE克隆、转化Escherichia coli DH10B后,可赋予后者Dnd表型,而当其中dptC缺失后,Dnd表型随之丧失。本文探索S.enterica serovar Cerro 87硫修饰基因dptC在硫修饰发生过程中的作用。【方法】将DptC中6个半胱氨酸(Cys)在DNA水平上逐个定点突变,转化携带dptBCDE及其衍生系列的质粒至E.coli DH10B,检测相应受体菌Dnd表型。【结果】在DptC的6个Cys中,除C39外,其余5个突变均可导致Dnd表型丧失,说明DptC中C146、C262、C273、C280和C283均与硫修饰有关。生物信息学分析表明,这5个Cys在硫修饰细菌科属间高度保守,佐证了S.enteric DptC中这5个Cys与硫修饰有关的结论。【结论】S.enteric DptC中C146、C262、C273、C280和C283任何一个的突变,都会导致受体菌Dnd表型丧失。该结果为进一步探索DNA硫修饰的发生机制提供了线索。
- 安贤惠周秀芬汪志军邓子新梁晶丹
- 关键词：SALMONELLAENTERICA定点突变
- 独特的硫化修饰DNA抗逆优势的发掘和应用研究进展报告
- 2016年
- 在细菌的DNA上进行磷硫酰化修饰(硫修饰),而硫修饰DNA在电泳过程中发生降解表型(DNA degradation,Dnd)。负责这种磷硫酰化修饰功能的蛋白由5个连锁并存在于一个基因组岛上的5个基因dnd A-E编码,其中4个基因dnd A和dnd C-E是磷硫酰化修饰所必需的基因。而对于生理学意义直到最近,才在天蓝色链霉菌中发现了特异地限制磷硫酰化DNA的基因,在沙门氏菌中发现了磷硫酰化修饰限制系统。到目前为止磷硫酰化修饰DNA电泳过程中降解机制不明,且其生理学意义知之甚少。用化学合成的模拟底物磷硫酰化修饰的二核苷d GSA和PAA-TAE激活液反应,作为研究磷硫酰化DNA电泳过程中降解机制的模拟反应,鉴定到6个产物。最终提出磷硫酰化DNA在电泳过程中发生的化学反应即降解机制,磷硫酰化DNA的最终命运有两种可能性,一种是磷硫酰化DNA可以在PAA等氧化剂的作用直接氧化到正常的DNA,或者先被氧化到氢膦酸酯然后再被氧化到正常的DNA而不会引起磷硫酰化DNA断裂降解;另一种是磷硫酰化DNA被PAA氧化到氢膦酸酯的DNA,然后被水解而表现为磷硫酰化DNA电泳过程中的降解。自然界的沙门氏菌含有磷硫酰化修饰DNA,能够作为抗氧化剂抵抗一定的氧化压力。当将编码沙门氏菌的整个dpt基因簇质粒转化到大肠杆菌DH10B中,赋予新宿主菌以磷硫酰化修饰DNA的特性,增加了宿主菌对抗过氧化氢的能力。证明磷硫酰化DNA可以给细菌带来抗氧化压力的能力,也可以解释为什么编码磷硫酰化修饰DNA的基因处于一个基因组岛上,使其能够在微生物间进行水平转移然后赋予新宿主以抵抗氧化压力的能力。综上所述,磷硫酰化DNA在电泳过程中降解主要是因为被过氧化物氧化生成氢膦酸酯化DNA,然后发生水解而断裂;磷硫酰化DNA能够作为抗氧化剂保护DNA免受氧化损伤,并消除一部分的氧化压力,从而提高宿主菌在氧�
- 汪志军梁晶丹
- 关键词：DNA降解抗氧化剂
- DndB蛋白负调控变铅青链霉菌dndA基因转录
- 2020年
- 为了探究变铅青链霉菌dndA基因转录调控机制,本研究利用LC-MS分析了野生型变铅青链霉菌1326和dndB基因同框缺失菌株HXY2的DNA硫修饰丰度差异。通过半定量RT-PCR比较dndA基因在1326与HXY2中的表达差异。用儿茶酚2,3-双加氧酶活力检测实验和对dndA启动子区域进行删除或突变来确定负责dndA基因表达调控的顺式作用元件。研究发现,HXY2的DNA硫修饰丰度高于1326,dndA基因在HXY2中的表达高于1326。儿茶酚2,3-双加氧酶活力检测实验显示,删除或突变r重复序列能使1326的dndA启动子活力明显升高。突变r重复序列后,HXY2的dndA启动子活力没有明显变化。结果显示,DndB蛋白抑制dndA基因转录进而下调DNA硫修饰丰度,以及DndB蛋白通过结合到r重复序列而抑制dndA基因转录。这是首次对dndA基因的转录调控机制进行研究,并且本研究进一步丰富了DndB蛋白的调控机理。
- 戴道凤徐冬梅汪志军唐爱发
- 关键词：变铅青链霉菌
- 人源脂肪酸合酶在酿酒酵母中的表达纯化和结构的初步分析
- 2021年
- 【背景】聚酮类化合物在医药领域有重要的应用,相关药物研发依赖聚酮合酶多变的结构认知,人源脂肪酸合酶的组成结构和催化机制与聚酮合酶相近,研究人源脂肪酸合酶结构可为聚酮合酶的研究奠定基础。【目的】在酿酒酵母中表达纯化人源脂肪酸合酶蛋白,确定合适的体外纯化条件。【方法】以酿酒酵母BJ5464为表达载体,构建带有His和Strep双亲和层析标签的重组质粒,诱导表达蛋白后用亲和层析方法获取目标蛋白,并结合凝胶电泳和快速蛋白质液相层析技术,确定合适的蛋白纯化条件。【结果】成功构建重组表达质粒pxw55-hfas-cSHII,并在体外纯化得到合适浓度和纯度的人源脂肪酸合酶蛋白,筛选不同缓冲液条件并结合电子显微镜观察结果反馈,确定合适的蛋白体外纯化体系。【结论】蛋白电镜结构分析需要有高纯度、合适浓度并且形成正确构象的蛋白样品,而人源脂肪酸合酶蛋白纯化体系的建立和纯化条件的确定为其电镜结构分析提供了良好的样品,为人源脂肪酸合酶的结构解析及结构相似但更为复杂的聚酮合酶蛋白解析奠定了良好基础。
- 王海龙王嘉良邓子新汪志军梁晶丹
- 关键词：蛋白纯化蛋白结构
