梁晶丹
- 作品数：20 被引量：8H指数：2
- 供职机构：上海交通大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划上海市浦江人才计划项目更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生更多>>
- 沙门氏菌硫修饰基因dptC的克隆表达与分离纯化被引量：1
- 2013年
- 【目的】细菌DNA磷硫酰化修饰是指DNA骨架非磷氧桥上的一个氧被硫取代,该修饰增加了机体的抗氧化作用,其发生受被称为dnd的基因簇控制。沙门氏菌(Salmonella entericaserovar Cerro 87)是具有磷硫酰化修饰现象的细菌之一,其dnd基因簇被命名为dptBCDE。本研究旨在克隆其中的dptC基因,优化dptC表达条件,为进一步研究DptC在DNA磷硫酰化修饰过程中的酶学功能奠定基础。【方法】以沙门氏菌总DNA为模板,设计特异引物、PCR扩增获得dptC基因片段,连接于表达载体pGEX-6P-1的SmaI和XhoI位点之间,构建融合表达载体pJTU3622;将pJTU3622转化大肠杆菌(Escherichia coliDH10B),经氨苄霉素抗性初选及序列测定,获得阳性克隆;提取阳性中pJTU3622再转化大肠杆菌表达宿主[E.coli BL21(DE3)pLysS],获得工程菌株Anxh103;优化表达条件,诱导表达dptC基因;采用GST-Trap柱和kata FPLC纯化系统分离纯化DptC蛋白。【结果】获得沙门氏菌dptC基因表达载体pJTU3622和工程菌株Anxh103;确定dptC最佳诱导表达条件为:诱导温度18℃,诱导时间8-18 h,IPTG诱导浓度0.6 mmol/L,LB培养基中添加50μmol/L Fe2+。【结论】成功克隆了沙门氏菌dptC基因,实现了沙门氏菌dptC基因的高通量表达;表达载体中引入TEV酶切位点,使得很容易切除GST标签,为进一步研究DptC的酶学功能奠定了基础;沙门氏菌DptC发酵体系中添加50μmol/L Fe2+可以提高DptC产量,纯化的DptC显示浅棕色,推测与变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中的同源蛋白蛋白DndC一样,也是一种含4Fe-4S的铁硫蛋白。
- 安贤惠周秀芬汪志军邓子新梁晶丹
- 关键词：SALMONELLAENTERICA基因克隆与表达
- 独特的硫化修饰DNA抗逆优势的发掘和应用研究进展报告
- 2016年
- 在细菌的DNA上进行磷硫酰化修饰(硫修饰),而硫修饰DNA在电泳过程中发生降解表型(DNA degradation,Dnd)。负责这种磷硫酰化修饰功能的蛋白由5个连锁并存在于一个基因组岛上的5个基因dnd A-E编码,其中4个基因dnd A和dnd C-E是磷硫酰化修饰所必需的基因。而对于生理学意义直到最近,才在天蓝色链霉菌中发现了特异地限制磷硫酰化DNA的基因,在沙门氏菌中发现了磷硫酰化修饰限制系统。到目前为止磷硫酰化修饰DNA电泳过程中降解机制不明,且其生理学意义知之甚少。用化学合成的模拟底物磷硫酰化修饰的二核苷d GSA和PAA-TAE激活液反应,作为研究磷硫酰化DNA电泳过程中降解机制的模拟反应,鉴定到6个产物。最终提出磷硫酰化DNA在电泳过程中发生的化学反应即降解机制,磷硫酰化DNA的最终命运有两种可能性,一种是磷硫酰化DNA可以在PAA等氧化剂的作用直接氧化到正常的DNA,或者先被氧化到氢膦酸酯然后再被氧化到正常的DNA而不会引起磷硫酰化DNA断裂降解;另一种是磷硫酰化DNA被PAA氧化到氢膦酸酯的DNA,然后被水解而表现为磷硫酰化DNA电泳过程中的降解。自然界的沙门氏菌含有磷硫酰化修饰DNA,能够作为抗氧化剂抵抗一定的氧化压力。当将编码沙门氏菌的整个dpt基因簇质粒转化到大肠杆菌DH10B中,赋予新宿主菌以磷硫酰化修饰DNA的特性,增加了宿主菌对抗过氧化氢的能力。证明磷硫酰化DNA可以给细菌带来抗氧化压力的能力,也可以解释为什么编码磷硫酰化修饰DNA的基因处于一个基因组岛上,使其能够在微生物间进行水平转移然后赋予新宿主以抵抗氧化压力的能力。综上所述,磷硫酰化DNA在电泳过程中降解主要是因为被过氧化物氧化生成氢膦酸酯化DNA,然后发生水解而断裂;磷硫酰化DNA能够作为抗氧化剂保护DNA免受氧化损伤,并消除一部分的氧化压力,从而提高宿主菌在氧�
- 汪志军梁晶丹
- 关键词：DNA降解抗氧化剂
- 人源脂肪酸合酶在酿酒酵母中的表达纯化和结构的初步分析
- 2021年
- 【背景】聚酮类化合物在医药领域有重要的应用,相关药物研发依赖聚酮合酶多变的结构认知,人源脂肪酸合酶的组成结构和催化机制与聚酮合酶相近,研究人源脂肪酸合酶结构可为聚酮合酶的研究奠定基础。【目的】在酿酒酵母中表达纯化人源脂肪酸合酶蛋白,确定合适的体外纯化条件。【方法】以酿酒酵母BJ5464为表达载体,构建带有His和Strep双亲和层析标签的重组质粒,诱导表达蛋白后用亲和层析方法获取目标蛋白,并结合凝胶电泳和快速蛋白质液相层析技术,确定合适的蛋白纯化条件。【结果】成功构建重组表达质粒pxw55-hfas-cSHII,并在体外纯化得到合适浓度和纯度的人源脂肪酸合酶蛋白,筛选不同缓冲液条件并结合电子显微镜观察结果反馈,确定合适的蛋白体外纯化体系。【结论】蛋白电镜结构分析需要有高纯度、合适浓度并且形成正确构象的蛋白样品,而人源脂肪酸合酶蛋白纯化体系的建立和纯化条件的确定为其电镜结构分析提供了良好的样品,为人源脂肪酸合酶的结构解析及结构相似但更为复杂的聚酮合酶蛋白解析奠定了良好基础。
- 王海龙王嘉良邓子新汪志军梁晶丹
- 关键词：蛋白纯化蛋白结构
- 林可链霉菌NRRL 2936中帕马霉素生物合成基因簇的异源表达及调控基因功能研究被引量：2
- 2018年
- 【背景】帕马霉素属于大环内酯类抗生素,具有较好的抗感染活性。该类化合物独特的化学结构和显著的生理活性受到了许多研究者的关注。同时,本实验室在林可链霉菌NRRL2936的全基因组序列中发现了帕马霉素的生物合成基因簇。【目的】尽管其生物合成途径已经得到了解析,但其生物合成基因簇中的2个调控基因功能尚不清楚。本研究从林可链霉菌NRRL2936的基因组文库中克隆了含有帕马霉素生物合成完整基因簇的质粒pJQK450,开展了质粒pJQK450在链霉菌中的异源表达,实现了帕马霉素的异源合成,并初步确定该生物合成基因簇中两个调控基因的功能。【方法】利用聚合酶链式反应递缩基因组文库筛选的方法,从林可链霉菌(Streptomyces lincolnensis)NRRL 2936基因组文库中筛选到了含有帕马霉素生物合成完整基因簇的Fosmid质粒pJQK450。然后,将该质粒转化到E.coli ET12567/pUZ8002中,利用大肠杆菌-链霉菌双亲接合转移的方法将pJQK450转入异源宿主中。对获得的异源表达菌株进行发酵产物的制备,采用耻垢分枝杆菌mc2155作为指示菌株进行帕马霉素生物活性测试,并结合LC-MS的分析确定帕马霉素的产生情况。最后,通过基因失活与回补的方法,考察帕马霉素生物合成基因簇中调控蛋白PamR1和PamR2对帕马霉素生物合成的影响。【结果】帕马霉素生物合成基因簇在天蓝色链霉菌M1154中实现了表达,证明PamR1和PamR2负调控了帕马霉素生物合成的过程。【结论】帕马霉素完整基因簇的成功异源表达,一方面便于其生物合成途径的遗传改造,为帕马霉素的生物合成及优产改造研究奠定了基础;另外,调控基因功能的研究为帕马霉素的产量优化提供了改造的目标。
- 蒋程恺孟思童张菲胡晓婧谢守锋陶美凤梁晶丹康前进白林泉邓子新
- 关键词：异源表达生物活性分析
- 酿酒酵母表达和纯化功能性的铁载体合成蛋白PchE
- 2021年
- 【目的】利用酿酒酵母表达系统,通过乙醇脱氢酶启动子异源表达细菌源的铁载体合成蛋白PchE,并与来源于枯草芽孢杆菌的泛酰化酶Sfp同宿主共表达,探索真核表达体系表达具有生化活性的细菌源蛋白。【方法】从大肠杆菌BAP 1染色体上扩增sfp基因,将pchE基因及串联的pchE与sfp基因分别构建到酵母-大肠杆菌穿梭质粒pXW55中,各自转化酿酒酵母BJ5464-npgA表达,经过亲和层析和离子交换层析纯化蛋白,利用HPLC检测细菌源与酵母源表达的PchE在体外重构生化反应中的催化活性。【结果】利用酿酒酵母表达系统可以获得高纯度的原核蛋白PchE。真菌源的泛酰化基因NpgA和细菌源的Sfp,均可泛酰化修饰PchE,合成中间产物HPT-Cys。【结论】在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BJ5464-npgA表达系统中,首次证明真菌源的泛酰化基因NpgA和细菌源的Sfp,均可泛酰化修饰细菌源的非核糖体肽合酶。比较酵母和细菌宿主的目标蛋白表达,证明酵母表达的巨大蛋白PchE的纯度更高,非特异性条带减少,推测酵母宿主可能更适合表达纯化功能性的巨型蛋白质。
- 陈璐王嘉良梁晶丹邓子新汪志军
- 关键词：酿酒酵母生化活性
- 变铅链霉菌中DNA位点专化性的硫修饰
- 变铬青链霉菌基因组DNA在电泳过程中发生降解,此现象被命名为Dnd(DNA degradation)。实验证实这是硫分子掺入DNA引起的表型。我们成功克隆了与此相关、定位在一段8 kb的基因组DNA序列上的五个基因,命名...
- 梁晶丹徐铁钢贺新义周秀芬邓子新
- 文献传递
- DNA大分子上一种新的硫修饰
- 自从Waston-Crick 阐明了作为生命中枢的DNA 大分子的结构以来,生物学的发展不断发生着质的变化和飞跃。尤其是在分子生物学的带动下,新学科,新领域不断诞生,新成果层出不穷,以至于到了20世纪90年代,人们开始预...
- 周秀芬贺新义梁晶丹李爱英徐铁钢T.KieserJ.Helmann邓子新
- 文献传递
- DNA硫修饰提升微生物对于多重极端环境胁迫的适应能力
- DNA磷硫酰化修饰是指在天然DNA骨架上发现的P-O键被P-S键替换的化学修饰，属于首例DNA骨架上的生理修饰.这种修饰由五个基因组成的dnd基因簇(dndA-E)编码的蛋白控制.DNA硫修饰在细菌界广泛存在，在动植物致...
- 许冠鹏杨艳梁晶丹汪志军肖湘
- Salmonella enteric硫修饰蛋白DptC半胱氨酸定点突变对Dnd表型的影响被引量：1
- 2013年
- 【目的】Salmonella enterica serovar Cerro 87是具有硫修饰现象即Dnd表型的细菌之一,其硫修饰受dptBCDE基因簇控制,将dptBCDE克隆、转化Escherichia coli DH10B后,可赋予后者Dnd表型,而当其中dptC缺失后,Dnd表型随之丧失。本文探索S.enterica serovar Cerro 87硫修饰基因dptC在硫修饰发生过程中的作用。【方法】将DptC中6个半胱氨酸(Cys)在DNA水平上逐个定点突变,转化携带dptBCDE及其衍生系列的质粒至E.coli DH10B,检测相应受体菌Dnd表型。【结果】在DptC的6个Cys中,除C39外,其余5个突变均可导致Dnd表型丧失,说明DptC中C146、C262、C273、C280和C283均与硫修饰有关。生物信息学分析表明,这5个Cys在硫修饰细菌科属间高度保守,佐证了S.enteric DptC中这5个Cys与硫修饰有关的结论。【结论】S.enteric DptC中C146、C262、C273、C280和C283任何一个的突变,都会导致受体菌Dnd表型丧失。该结果为进一步探索DNA硫修饰的发生机制提供了线索。
- 安贤惠周秀芬汪志军邓子新梁晶丹
- 关键词：SALMONELLAENTERICA定点突变
- DNA硫修饰的发现及其化学结构
- 邓子新周秀芬王连荣贺新义梁晶丹
- 该项目属于生物学基础研究领域，研究的是生命的遗传物质DNA大分子上的一种异常修饰。DNA上的细微变化都会引发个体在一系列生命过程发生巨变而导致突变、畸形、疾病的发生。虽然DNA和RNA都是由碱基、糖环、磷酸二酯键三部分组...
- 关键词：
- 关键词：遗传修饰磷酸二酯键生物学化学结构
