孙国敬
- 作品数：21 被引量：99H指数：6
- 供职机构：军事医学科学院放射与辐射医学研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- PKA磷酸化p21^(WAF)后对其泛素化修饰和稳定性的影响
- 2005年
- 目的:探索p21被蛋白激酶A(PKA)磷酸化修饰后对其泛素化修饰和稳定性的影响。方法:构建p21可能磷酸化位点的突变体p21 T145A,观察PKA体外磷酸化修饰p21;W estern印迹分析PKA特异性抑制剂H89对p21稳定性的影响;通过免疫沉淀分析H89对p21泛素化修饰的影响以及p21 Thr 145突变前后和Skp2结合能力的变化。结果:PKA体外磷酸化修饰p21的Thr 145;PKA特异性抑制剂H89能够提高p21的稳定性并抑制p21的泛素化修饰;野生型(w ild)p21比p21 T145A结合Skp2的能力强。结论:PKA磷酸化修饰p21的Thr145后导致其结合E3连接酶结合亚基Skp2的能力增强,从而促进p21的泛素化修饰,导致p21稳定性的降低。
- 钱俊杰孙国敬宋宜梅柱中董燕刘斌孙志贤
- 关键词：蛋白激酶A泛素化修饰SKP2细胞周期蛋白质类
- 凋亡素的克隆及诱导HeLa细胞凋亡被引量：8
- 2001年
- 目的 :克隆凋亡素 (apoptin)的全长基因 ,在肿瘤细胞HeLa中表达并诱导其凋亡。方法 :从CAV病毒基因组TK580 3中通过PCR技术扩增凋亡素基因 ,直接克隆至真核表达载体pCDNA3.1/His/Topo ,序列测定证实其正确性 ,并克隆至pCIneo真核表达载体构建重组表达载体。采用脂质体转染HeLa细胞 ,转染 3d后Honchest332 58染色并于荧光显微镜下观察细胞状态。结果与讨论 :核酸序列分析证实所克隆的凋亡素基因与文献报道的一致 ,将其成功克隆至真核表达载体pCDNA3.1/His/Topo和pCIneo ,构建了真核重组质粒pCIneo apoptin和pCDNA3.1/His/Topo apoptin ,转染HeLa细胞 3d后可见明显的细胞凋亡 ,而只转染空质粒的对照组则较少。表明凋亡素能够有效地诱导HeLa细胞凋亡。
- 孙国敬童新孙志贤
- 关键词：凋亡素克隆HELA细胞凋亡聚合酶链反应基因转染肿瘤
- Skp2参与HeLa细胞G_2/M周期检查点的调控被引量：5
- 2005年
- 具癌基因特性的Skp2在大多数肿瘤组织和肿瘤细胞中异常高表达,它作为SCFSkp2复合物的底物识别亚基调控p27KIP蛋白的稳定性而促进细胞G1/S期转换.为进一步明确Skp2与G2/M周期检查点的关系,在HeLa细胞中过表达Skp2以及通过反义寡核苷酸抑制Skp2表达.结果发现:Skp2能促进细胞周期运转,表现为S期细胞增多和G2/M期细胞减少,其中F-box结构域具有重要的功能意义;反义寡核苷酸抑制Skp2表达后,HeLa细胞发生显著的G2/M期阻滞;MTT检测结果表明,400nmol/L的Skp2的反义寡核苷酸能明显抑制HeLa细胞的增殖活性;Western印迹结果表明,HeLa细胞中Skp2可能通过负调控p21WAF的稳定性来参与G2/M检查点调控,这在用放线菌素D处理HeLa细胞的实验中得到验证.这些结果初步揭示了Skp2参与HeLa细胞G2/M周期检查点调控的分子机制.
- 钱俊杰孙国敬孟祥兵宋宜梅柱中刘斌董燕孙志贤
- 关键词：SKP2
- 从人白细胞cDNA文库筛选凋亡素相互作用蛋白被引量：10
- 2001年
- 来源于鸡贫血病毒的小分子蛋白 凋亡素 (apoptin)能够选择性诱导肿瘤细胞凋亡 ,为研究其选择性诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制 ,利用酵母双杂交系统筛选从人白细胞cDNA文库筛选apoptin相互作用蛋白 ,核酸序列分析及同源性检索表明 ,其中一个与ABP2 80 (actin bindingprotein 2 80 )有高度同源性 .细胞免疫共沉淀实验结果显示 :在哺乳动物细胞水平仍能够检测到apoptin与ABP2 80片段的特异的相互作用 .分别构建缺失C端 11个氨基酸、中间 33～ 46位氨基酸和二者均缺失的apoptin的 3个突变体 ,突变体与ABP2 80相互作用研究表明 :apoptin的 33～ 46位氨基酸 (核外运信号 )对于apoptin与ABP2 80的相互作用是必需的 ,而C端核定位信号 /DNA结合序列对于apoptin与ABP2
- 孙国敬童新孟祥兵董燕孙志贤
- 关键词：凋亡素酵母双杂交免疫共沉淀人白细胞CDNA文库
- TSA诱导MOLT-4细胞中p21^(WAF1/Cip-1)表达的功能机制研究被引量：2
- 2005年
- 为了研究去乙酰化酶抑制剂TSA诱导MOLT-4细胞周期阻滞和凋亡反应中p21WAFl/Cip-1的表达及其功能, 以组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理急性淋巴细胞白血病细胞系MOLT-4,流式细胞仪和细胞吖啶橙染色、瑞士染 色检测细胞周期和凋亡,Western检测p21p21WAFl/Cip-1的表达。结果表明:组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可有效的诱导 MOLT-4细胞发生G2／M阻滞和凋亡,并且呈现明显的剂量效应关系和时间效应关系;在此周期阻滞与凋亡反应过 程中,p21WAFl/Cip-1蛋白的表达水平在周期阻滞前快速增高,而在凋亡早期开始下降。p21WAFl/Cip-1分子在细胞中的表 达规律与TSA诱导的细胞G2／M阻滞和凋亡反应间存在明显的剂量效应关系和时间效应关系;蛋白酶体抑制剂 MG-132提升p21WAFl/Cip-1分子在细胞中的表达可以增进细胞的G2／M阻滞反应而延缓凋亡。结论:蛋白酶体途径参 与TSA诱导的MOLT-4细胞周期阻滞向凋亡转换过程中p21WAFl/Cip-1分子的降解调控;p21WAFl/Cip-1在TSA诱导的 MOLT-4细胞G2／M阻滞和凋亡反应中起着重要调节作用。
- 宋宜刘梅菊赵国伟钱俊杰董燕刘华孙国敬梅柱中刘斌田宝磊孙志贤
- 关键词：TSAMOLT-4细胞MG-132
- 蛋白酶体抑制剂MG132诱导HL-60细胞凋亡前G_2/M期阻滞及机制被引量：18
- 2004年
- 背景和目的:蛋白酶体(proteasome)抑制剂能够诱导多种肿瘤细胞凋亡,是一种潜在的有应用前景的抗肿瘤剂。本研究旨在探讨蛋白酶体抑制剂MG132(Z-Leu-Leu-Leu-CHO)诱导白血病细胞HL-60凋亡和G2/M期阻滞的机制。方法:采用荧光显微镜观察、流式细胞术和免疫印迹研究测定MG132诱导HL-60细胞凋亡和周期阻滞及机制。结果:2μmol/L的MG132能够有效地诱导HL-60细胞凋亡,用药后24h就显现有细胞凋亡;在MG132诱导HL-60细胞凋亡出现之前有一个明显的G2/M期阻滞,加MG132后12h时G2/M期时相百分比为63.42±2.02;24h时加MG132组细胞凋亡为16.67±1.48,与对照组G2/M期时相百分比为7.29±3.01及细胞凋亡为0相比,两者之间有显著性差别(P<0.01);咖啡因CAF能够减少MG132诱导HL-60细胞出现的G2/M期阻滞,同时也减少凋亡细胞的比例;细胞周期检查点的负调控因子p21waf/cip1蛋白在加MG132处理后3h有明显的表达,但并未能检测到p53和p27蛋白。结论:MG132诱导HL-60细胞凋亡之前有一个明显的G2/M期阻滞,p21蛋白表达明显上调提示:是p21waf/cip1而不是p53或其同源蛋白参与了其中的调控。
- 孙国敬钱俊杰孟祥兵宋宜张枫梅柱中董燕孙志贤
- 关键词：HL-60细胞G2/M期阻滞细胞凋亡蛋白酶体抑制剂P21蛋白负调控因子
- HeLa细胞中Skp2的表达调控p21WAFCIP1稳定性被引量：6
- 2004年
- 泛素 蛋白酶体抑制剂MG 132处理的HeLa和SaoS 2细胞中 ,低表达的p2 1WAF CIP1受泛素 蛋白酶体通路调控 .为探讨肿瘤细胞中高表达的E3连接酶底物结合亚基 Skp2和低表达的p2 1WAF CIP1之间的关系 ,在HeLa细胞中转染Skp2的反义寡核苷酸后 ,p2 1表达水平明显升高 .同时 ,相对于转染空载体和Skp2ΔF(Skp2的F box缺失突变体 )的真核表达载体 ,转染全长Skp2的HeLa细胞中 ,p2 1表达水平显著下降 ,说明肿瘤细胞中Skp2调节p2 1的稳定性 ,并且这种调控作用依赖于Skp2蛋白中的F box结构 .免疫荧光结果表明 ,Skp2和p2 1共定位于细胞核 ,这为两者间的相互作用提供了前提 ;体内相互免疫共沉淀结果表明 ,p2 1和其它SCFSkp2 的底物一样与Skp2直接结合 ,并且它们之间的结合区不在F box结构域 ,这一结果在体外的GST
- 钱俊杰孙国敬孟祥兵宋宜梅柱中刘斌董燕孙志贤
- 关键词：SKP2泛素-蛋白酶体通路
- Apoptin选择性诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制
- 该研究建立了apoptin诱导Hela细胞凋亡的细胞模型;成功表达纯化了apoptin蛋白并将其复性,研究表明apoptin蛋白在体外即使没有细胞质参与,仍能有效的诱导细胞核凋亡;实验结果显示单独apoptin蛋白无转录...
- 孙国敬
- 关键词：凋亡素肿瘤细胞凋亡酵母双杂交
- 文献传递
- DNA错配修复基因MutS的克隆、表达及功能研究
- 该实验进行了E.coli MutS基因的克隆、表达及功能测定工作.首先,通过聚合酶链式反应PCR从E.coli基因组中扩增得到了MutS基因(2.6kb).然后将其克隆在pGEM-T载体上,构建了重组质粒载体pGEM-...
- 孙国敬
- 关键词：错配修复克隆基因大肠杆菌
- 凋亡素Apoptin选择性诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制
- 来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)VP3蛋白的凋亡素apoptin能够选择性诱导肿瘤细胞凋亡,且不依赖于p53的介导,不被Bcl-2过表达所抑制,不易产生耐药性,被认为是真正意义上的第一...
- 孙国敬童新孙志贤
- 文献传递
