钱海华
- 作品数：28 被引量：127H指数：8
- 供职机构：第二军医大学东方肝胆外科医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- mda-7／IL-24通过内质网应激通路诱导肝癌细胞生长抑制和凋亡被引量：4
- 2008年
- 目的:观察mda-7/IL-24对不同类型的肝肿瘤细胞及正常肝脏细胞增殖及凋亡的影响并探讨其可能的作用机制。方法:构建携带mda-7基因的重组腺病毒Ad-mda-7,转染肝癌细胞系HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5和正常肝细胞L02,MTT法和流式细胞术检测细胞增殖及凋亡情况,Western印迹检测细胞相关蛋白的表达。应用钙蛋白酶抑制剂Ⅰ(ALLN,25μmol/L)预处理上述细胞30min,观察阻断内质网应激通路后上述指标的变化。结果:MTT法和流式细胞术检测结果表明,与感染Ad-GFP比较,Ad-mda-7选择性抑制肝癌细胞生长(P<0.01),诱导肝癌细胞凋亡(P<0.01,其中对HepG2细胞影响最明显),而对正常肝细胞生长无明显影响;ALLN预处理能部分抑制Ad-mda-7的上述作用。Western印迹结果表明Ad-mda-7能诱导HepG2细胞BiP/GRP78、Bax蛋白高表达(P<0.01),caspase-12、caspase-3活化及p38 MAPK磷酸化;ALLN预处理能抑制Ad-mda-7转染引起的Bax蛋白高表达及caspase-12、caspase-3活化;而对BiP/GRP78的高表达及p38 MAPK磷酸化无影响。结论:mda-7/IL-24可能通过内质网应激通路诱导肝癌细胞生长抑制和凋亡。
- 张小峰施乐华艾莉康晓燕温莹浩钱海华张妤殷正丰
- 关键词：内质网应激肝肿瘤
- 曲格列酮对肝癌HepG2细胞生长和分化的影响被引量：1
- 2008年
- 目的探讨过氧化物酶体增殖物活化受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）γ激动剂曲格列酮对肝癌HepG2细胞生长和分化的影响。方法以曲格列酮处理体外培养的肝癌HepG2细胞，MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期，分化标记物E-钙黏蛋白和清蛋白分别用免疫细胞化学和溴甲酚绿法检测，化学发光法检测肿瘤标记物AFP。Western blot检测细胞周期蛋白D1、c—myc蛋白的表达。结果曲格列酮以浓度依赖性方式抑制肝癌细胞生长，使细胞周期明显阻滞于G0／G1，并诱导E-钙黏蛋白表达。经曲格列酮处理后，清蛋白分泌量显著增加，AFP明显下降，细胞周期蛋白D1、c-myc蛋白表达水平下降。结论曲格列酮可诱导肝癌细胞分化，抑制其生长，其机制可能涉及下调细胞周期蛋白D1和c-myc蛋白表达。
- 周彦明温莹浩康晓燕钱海华李殿启杨甲梅殷正丰
- 关键词：曲格列酮肝肿瘤
- 癌灶内注射腺病毒介导的血管内皮生长因子启动子-胸苷激酶基因治疗大鼠肝癌被引量：3
- 2003年
- 目的研究腺病毒介导的血管内皮生长因子启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(AdVEGF tk)对大鼠肝癌的治疗作用。方法以二乙基亚硝胺 (DEN)诱导Wistar大鼠产生肝癌 ,将成癌鼠随机分组 ,在同鼠肝内的多发性癌灶中选取 2个孤立的癌灶分别作为参照癌和处理癌 ,记录癌灶直径。参照癌不作处理。处理癌分别用不同的重组腺病毒癌内注射 ,并从次日起连续 10d每天腹腔内给予丙氧鸟苷 (GCV)或生理盐水 1次。停止注射后第 10天剖腹测量处理癌和参照癌大小 ,比较各组间癌灶体积增长率。结果用低浓度DEN处理 12 0d ,所有被探查的大鼠均有典型的肝癌形成。与同鼠中参照癌相比 ,AdVEGF tk/生理盐水处理的癌灶体积增长率平均值差异无显著意义 (P>0 0 5 ) ,而AdCMV tk/GCV和AdVEGF tk/GCV处理的癌灶体积增长率平均值显著降低 (P <0 0 1) ,与AdVEGF tk/生理盐水组处理癌和参照癌的体积增长率平均值之间的差异也有显著意义 (P<0 0 1)。AdVEGF tk/GCV处理癌与AdCMV tk/GCV处理癌体积增长率之间差异无显著意义 (P>0 0 5 )。结论癌灶内注射AdVEGF tk对大鼠肝癌生长具有明显抑制作用。
- 王孟龙殷正丰吴宗娣钱海华康晓燕罗祥基吴孟超
- 关键词：血管内皮生长因子启动子胸苷激酶基因治疗肝癌
- 快速大容量尾静脉注射法构建循环肝癌细胞肝转移小鼠模型被引量：2
- 2014年
- 目的:通过快速大容量尾静脉注射方法构建循环肝癌细胞肝内复发转移小鼠模型。方法:40只C57BL/6J小鼠采用随机数字表法随机分为对照组和实验组(20只/组),对照组采用传统的缓慢小容量尾静脉注射法(2×106个肝癌Hepa1-6细胞/0.2 ml,30 s内注射完毕),实验组采用改良的快速大容量尾静脉注射法(2×106个肝癌Hepa1-6细胞/2 ml,5 s内注射完毕)构建循环肝癌细胞肝内复发转移小鼠模型。4周后摘取肝、肺、肾、脾组织并行H-E染色,大体和镜下观察肝脏、肺脏、脾脏和肾脏的成瘤情况。结果:对照组小鼠只在肺脏有转移灶形成,成瘤率为95%(19/20),肝脏、肾脏、脾脏未见有转移灶形成。实验组小鼠在肝脏和肺脏同时形成转移灶,肺脏成瘤率为94.7%(18/19),肝脏成瘤率为100%(19/19),脾脏、肾脏未见转移灶形成。结论:快速大容量尾静脉注射法注射循环肝癌细胞构建的小鼠模型可以模拟肝癌根治性切除后残留的循环肝癌细胞导致早期肝癌肝内复发转移的过程。
- 时志龙孙斌陈磊钱海华张孝峰殷正丰
- 关键词：肝转移
- 重组人中期因子的原核表达、纯化及生物学活性鉴定被引量：7
- 2004年
- 目的 :表达和纯化具有生物学活性的重组人中期因子蛋白。方法 :应用 RT- PCR从人肝细胞癌组织总 RNA中扩增中期因子 c DNA,将其克隆到表达载体 p ET- 2 4 a,在大肠杆菌中诱导表达 ,经肝素 -琼脂糖亲和层析柱纯化 ,应用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹和细胞增殖试验对纯化产物进行分析鉴定。 结果 :构建的重组质粒 p ET- HMK能在大肠杆菌中高表达 ,诱导表达的蛋白主要存在于包涵体中 ,经肝素 -琼脂糖柱亲和层析后纯化产物呈单一条带 ,特异性抗体反应证实是重组人中期因子 ,细胞增殖试验显示其能有效促进 NIH 3T3细胞生长 ,并且具有剂量依赖性。结论
- 钱海华康晓燕殷正丰王翠红李瑾吴孟超
- 关键词：原核表达纯化生物学活性
- 人去唾液酸糖蛋白受体单克隆抗体制备及其初步应用被引量：2
- 2013年
- 目的制备人去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的小鼠单克隆抗体,并应用该抗体检测ASGPR在细胞系和组织中的表达。方法对ASGPR H1大亚基进行序列分析,选取ASGPR1全长序列制备免疫原。通过RT-PCR合成ASGPR1cDNA,构建ASGPR1表达重组载体,在E.coli BL21中表达后纯化,获得目的抗原。应用传统融合杂交瘤技术制备小鼠单克隆抗体,常规检测单抗亚类和效价,竞争抑制实验鉴定单抗特异性。用流式细胞术和免疫组织化学法分别检测ASGPR在多种肝源性与非肝源性细胞系以及多种肝组织中的表达。结果制备的单克隆抗体亚型为IgG1,效价达112 800。竞争抑制实验结果显示该单抗具有很好的ASGPR结合特异性,而且识别的肽段位于ASGPR胞外段。流式细胞术检测结果显示,ASGPR不同程度地表达于肝源性细胞系,但不表达于非肝源性细胞系。免疫组织化学检测结果显示,ASGPR专一性表达于正常肝组织和肝癌组织,在肝癌组织的表达与分化程度有关,高分化肝癌中的阳性率高于低分化肝癌(75.0%vs 28.6%,P<0.05)。结论成功制备高特异性人ASGPR小鼠单克隆抗体,适用于用流式细胞术和免疫组织化学法检测ASGPR表达,可用于临床病理鉴定原发性肝癌与转移性肝癌。
- 李军陈磊孙斌张妤钱海华殷正丰
- 关键词：去唾液酸糖蛋白受体单克隆抗体肝肿瘤流式细胞术免疫组织化学
- 中期因子mRNA在原发性肝癌中的表达及其意义被引量：5
- 2002年
- 目的 探讨中期因子 (MK)mRNA在原发性肝细胞癌 (HCC)中的表达及其意义。方法 收集 33例人肝细胞癌组织、配对癌旁肝组织及 1 0例肝良性肿瘤组织、5例正常肝组织 ,采用TRIzol一步抽提法提取总RNA ,应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测MKmRNA的表达。结果 2 8例肝细胞癌可见MKmRNA表达 ,阳性率为 84.8% ,而配对的癌旁组织中仅见 3例表达 ,正常肝脏和肝脏良性肿瘤组织无 1例阳性。统计学分析表明 ,肝细胞癌MKmRNA表达率与其他各组的差异有非常显著性 (P <0 .0 1 ) ,但肝细胞癌MKmRNA表达与其组织学类型、病理分级、瘤体大小、包膜状况及其甲胎蛋白 (AFP)值之间差异无显著性 (P >0 .0 5)。结论 肝细胞癌在mR NA水平上表达MK增加 ,检测MK表达情况可作为HCC的辅助诊断指标之一 。
- 罗祥基殷正丰吴宗娣康晓燕钱海华吴孟超
- 关键词：MRNA原发性肝癌肿瘤标志物
- 寡克隆肝癌浸润淋巴细胞的制备及其对自体癌细胞的杀伤活性
- 2013年
- 目的:建立一种新的寡克隆肝癌浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)分离培养方法,获得具有更强自体肝癌细胞杀伤活性的TIL。方法:以新鲜切除的人肝癌组织标本为材料,分别采用酶消化结合整块肝癌组织机械处理的传统方法和微小肝癌组织块培养的方法分离制备常规TIL和寡克隆TIL,培养2周后,将靶细胞毒活性较高的寡克隆TIL合并进一步培养扩增,采用MTT法分析不同寡克隆TIL对自体肝癌细胞的杀伤活性,比较不同寡克隆TIL之间、常规TIL和寡克隆TIL对自体肝癌细胞的杀伤活性。结果:在含有IL-2的培养体系中,TIL可自行从微小肝癌组织块中逐渐浸润出来并增殖。各个寡克隆TIL对自体肝癌细胞均有一定的杀伤活性,但是不同寡克隆TIL对于自体肝癌细胞的细胞毒活性有明显差异(P<0.01),寡克隆肝癌TIL对于自体肝癌细胞的细胞毒活性明显高于常规肝癌TIL[(72.56±6.69)%vs(46.24±4.03)%,P<0.01]。结论:寡克隆TIL分离培养方法制备的寡克隆肝癌TIL较常规TIL具有更强的自体肝癌细胞杀伤活性。
- 张宗勤陈磊李鹏鹏张小峰孙斌钱海华施乐华殷正丰
- 关键词：肿瘤浸润淋巴细胞细胞毒活性
- 重组人成纤维细胞生长因子-20的原核表达、生物学活性鉴定及抗血清制备被引量：1
- 2006年
- 目的：表达具有生物学活性的重组人成纤维细胞生长因子-20（rhFGF-20），并制备rhFGF-20抗血清。方法：应用RT—PCR从人前列腺组织总RNA中扩增FGF-20的cDNA，将其克隆到pET24a中，在大肠杆菌中诱导表达，经NTA—Ni^2＋-琼脂糖亲和层析纯化，应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、细胞增殖试验进行分析鉴定，并免疫新西兰雄性白兔制备多克隆抗体，免疫双扩散法测定抗体效价。结果：构建的pET24aFGF-20能在大肠杆菌中高表达；诱导表达的rhFGF-20蛋白主要存在于包含体中，经包含体溶解、Ni^2＋-NTAHis—Bind Resins亲和层析后，纯化产物呈单一条带；细胞增殖试验显示其能促进成纤维细胞生长，并具有剂量依赖性（浓度为50～5000ng／ml）；制备的抗血清效价为1：32，可与hFGF20产生免疫反应。结论：大肠杆菌表达的rhFGF-20蛋白具有刺激成纤维细胞增殖的活性，制备的抗血清具有特异性。
- 姜治国殷正丰钱海华康晓燕罗祥基李瑾
- 关键词：原核表达免疫血清
- 肝细胞癌高表达中期因子蛋白与肝内转移的关系被引量：15
- 2002年
- 目的 探讨中期因子 (midkine ,MK)蛋白在肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)中的表达特点、水平及其与肝内侵袭、转移的可能关系。方法 应用免疫组织化学染色、Western印迹等方法 ,对 33例人HCC组织、10例良性肝肿瘤组织及其配对瘤旁肝组织进行了MK蛋白定位表达及表达水平的研究 ,并结合肝内有无卫星灶形成进行分析。结果 免疫组织化学结果与Western印迹结果具有一致性 (P >0 .0 5 )。在正常肝组织及良性肝病变组织中 ,MK无表达 ;而在HCC组织中 ,MK高表达。在癌旁肝硬化组织中 ,MK微量表达 ;而在肿瘤侵袭前沿区域 ,MK表达则增强。HCC中MK表达率与其组织学类型、组织分级、瘤体大小、包膜状况、AFP值之间差异均无显著性 (P >0 .0 5 ) ,但在有卫星灶形成的HCC中 ,MK蛋白表达率显著高于无卫星灶形成者 (P <0 .0 5 )。结论 HCC在蛋白水平上表达MK增加 ,并可能与肝内侵袭、转移有关。
- 殷正丰罗祥基康晓燕吴宗娣钱海华吴孟超
- 关键词：肝肿瘤肝细胞癌中期因子蛋白免疫组织化学
