蒋大良
- 作品数：27 被引量：61H指数：4
- 供职机构：湖南农业大学动物医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金湖南省科技重大专项国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学轻工技术与工程更多>>
- 副猪嗜血杆菌Neu基因的克隆表达及表达产物的免疫原性被引量：4
- 2010年
- 为研究副猪嗜血杆菌(HPS)基因工程疫苗,以HPS5型毒株为模板,通过PCR扩增获得副猪嗜血杆菌神经氨酸酶(Neu)全基因,将其克隆至pMD18-T载体并对其进行测定和分析。结果表明,Neu全基因含一个2187bp的开放阅读框,编码一含729个氨基酸的蛋白,与Neu基因参考序列(登录号:NZ-ABKM01000006)的同源性为99.0%。以pMD-Neu基因为模板,重新设计引物,扩增得到HPSNeu蛋白的部分编码区,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建得到重组原核表达质粒pET-Neu。将pET-Neu在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行优化表达,经SDS-PAGE分析,重组蛋白Neu主要以包涵体形式表达,分子质量为52ku;Western-blot分析表明,重组蛋白Neu能与阳性血清发生特异性抗原反应。将纯化重组蛋白Neu试验性注射免疫昆明小鼠,攻毒试验结果显示,氢氧化铝佐剂组的保护性较低,仅有10%;而弗氏佐剂组具有较高的保护性,保护率高达60%。
- 刘俊琦余兴龙蒋大良朱小宁李润成肖利军刘春红罗维葛猛
- 关键词：副猪嗜血杆菌神经氨酸酶原核表达免疫原性
- 猪圆环病毒2型Rep蛋白ELISA抗体检测方法的建立被引量：3
- 2012年
- 为建立一种快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的方法,本研究通过基因合成PCV2的Rep编码序列,将其克隆至pET-28a(+)并在E.coli中表达,表达的重组Rep蛋白经Ni2+亲和纯化。采用纯化的目的蛋白作为包被抗原,建立检测PCV2 Rep蛋白抗体的间接ELISA方法。结果表明最佳抗原包被浓度为200 ng/孔,血清和二抗最佳反应时间分别为1 h和30 min。该方法具有良好的特异性和敏感性,与韩国金诺公司试剂盒的符合率为81.4%,表明建立的ELISA方法可以用于PCV2的流行病学检测。
- 李杰葛猛罗维舒晓亮蒋大良李润成李波刘国华余兴龙
- 关键词：猪圆环病毒REP蛋白间接ELISA
- 快速鉴定猪肉和牛肉多重PCR方法的建立及初步应用被引量：9
- 2011年
- 建立了快速有效地鉴定猪肉和牛肉的多重PCR方法。根据GenBankTM登陆的猪和牛的线粒体基因序列设计特异性引物,通过PCR条件优化建立起多重PCR方法,并评价该方法的敏感性和特异性。结果表明,该多重PCR方法能特异性扩增到目的大小的牛和猪线粒体基因片段;该方法不能扩增羊、鸡、狗等8种常见动物线粒体基因组片段;该方法最低能检测到牛DNA9.8×101fg/μ L和猪DNA6.7×101fg/μ L;能检测出市场上猪肉和牛肉商品中的假冒产品。该方法具有高度的特异性和敏感性,能够快速鉴别检测猪肉和牛肉商品。
- 李杰乔绪稳余兴龙李润成肖朝庭刘国华蒋大良
- 关键词：多重PCR牛肉猪肉
- 规模猪场母猪群猪瘟抗体监测与补苗效果分析被引量：1
- 2012年
- 为了解规模猪场母猪群猪瘟抗体情况,评价猪瘟疫苗加强免疫的效果。对2个规模猪场的母猪群进行了猪瘟抗体检测、补苗、再检测、再补苗的过程。结果表明母猪群通过科学的增加猪瘟疫苗接种能明显提升猪瘟抗体水平,但2个猪场的母猪群中均有少数母猪通过反复接种疫苗仍不能产生较好的猪瘟抗体,不具备对猪瘟病毒的抵抗能力,规模猪场应该对这些母猪进行淘汰,减少猪瘟病毒在猪场传播的可能性。
- 李润成颜爱葛猛蒋大良余兴龙
- 关键词：母猪群猪瘟疫苗
- 4种茶叶水提物对猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用被引量：3
- 2012年
- 采用小鼠体内试验和体外试验,利用Marc–145细胞体外培养系统,通过观察细胞病变来评价茶叶水提物对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)繁殖的抑制作用。改变加入茶叶水提取物的方式(茶叶水提物先与病毒感作后接种细胞、茶叶水提物与已感染病毒的细胞作用2种方式),初步探讨茶叶水提物对PRRSV的抑制与杀灭作用。体内试验是采用小鼠尾静脉注射的方法,将茶叶水提物注射到小鼠体内,测定小鼠血清对PRRSV的作用。结果表明,茶叶水提物对PRRSV具有杀灭与抑制作用,碧螺春茶(不发酵)、生普洱茶(不发酵)、铁观音茶(半发酵)、熟普洱茶(后发酵)的水提物对PRRSV的最小抑制质量浓度分别为31.3、31.3、31.3、125μg/mL,最小杀灭质量浓度分别为7.8、7.8、15.6、125μg/mL。不发酵型茶叶水提物比发酵型茶叶水提物对PRRSV的杀灭与抑制作用明显,小鼠尾静脉注射茶叶水提物后能正常生长,注射1 h内小鼠血清对PRRSV具有一定的杀灭作用。
- 周洪锐汤起武余兴龙李润成罗维蒋大良葛猛
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征MARC-145细胞
- 检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒
- 一种检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒，该试剂盒依双抗原夹心ELISA原理研制而成，包括ELISA抗原预包被板条、洗涤液、100倍浓缩的酶标抗原、酶标稀释液、底物显色液、终止液及标准PCV2阴、阳性血清。本试剂盒采...
- 余兴龙葛猛李润成蒋大良罗维
- 文献传递
- 猪瘟病毒NS3基因克隆、原核表达及间接ELISA方法初步建立
- 采用PCR方法从猪瘟病毒兔化弱毒(Hog Cholera Lapinized Virus HCLV)疫苗株cDNA中扩增到长度为2000bp左右NS3基因序列,将其克隆进原核表达载体pET32a(+),构建重组原核表达载...
- 蒋大良余兴龙李润成葛猛颜爱李杰刘春红刘俊琦
- 关键词：基因克隆原核表达免疫印迹间接ELISA
- 文献传递
- 适合猪圆环病毒2生长的PK15均质细胞株的构建被引量：5
- 2013年
- 为筛选出PCV2培养滴度最高的PK15细胞克隆株,采用稀释法从PK15混合细胞中分离单细胞克隆株,获得的细胞克隆用于接毒试验,即用同步接种法将猪圆环病毒2(PCV2)病毒细胞混合液以1∶100的比例接种单克隆细胞,接毒后经PCR与定量PCR检测得出A10细胞克隆培养PCV2,获得的病毒含量最高。将A10细胞进行第2轮细胞克隆,之后用同步接种法和异步接种法将PCV2感染A10细胞,并检测A10细胞接毒后的PCV2 DNA含量,2种接毒方法获得的最高PCV2基因组的拷贝数分别为3.0×109、6.2×109/mL,高于用PK15混合细胞培养PCV2所获得的最高PCV2基因组拷贝数(107/mL)。综合以上结果,构建的PK15均质细胞克隆株比PK15混合细胞更适合PCV2的培养。
- 罗维赵墩蒋大良余兴龙
- 关键词：PK15细胞细胞克隆定量PCR
- Shotgun质谱筛选与猪瘟病毒囊膜蛋白E^rns相互作用的候选宿主蛋白
- 2013年
- 猪瘟病毒(CSFV)Erns蛋白是瘟病毒属成员特有的囊膜糖蛋白,在病毒吸附和侵入靶细胞过程中发挥重要作用。本研究利用Erns特异性抗体对CSFV石门强毒株感染的PK-15细胞进行免疫共沉淀(Co-IP),对获得的蛋白复合物进行Shotgun质谱鉴定。结果显示,与阴性对照相比,病毒感染细胞样品中含有199种差异蛋白,其中可能包含与Erns作用的宿主细胞蛋白。同时,实验还对Co-IP蛋白样品进行SDS-PAGE,切取差异条带进行质谱分析以进一步验证Shotgun技术的蛋白筛选结果。通过Co-IP和Shotgun质谱分析,本研究筛选出一些可能在CSFV生命周期中与Erns互作用的宿主蛋白,为进一步研究CSFV在宿主细胞中的感染和复制的分子机制奠定基础。
- 尹凝蒋大良龚文杰郭焕成谢金鑫夏乐乐余兴龙涂长春
- 关键词：猪瘟病毒蛋白质相互作用SHOTGUN
- 猪瘟病毒亚基因复制子及其细胞系的构建被引量：3
- 2016年
- 为探索猪瘟病毒(CSFV)的复制机理,本实验在前期CSFV流行株GD53全基因组测序的基础上,利用新霉素抗性基因(Neor)替换病毒结构蛋白基因以构建CSFV GD53株的亚基因组复制子(GD53-SGR)。首先构建含有T7-5'UTR-N^(pro)-Neor-EMCV/IRES-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-3'UTR的重组质粒pc DNA-GD53-SGR,将其利用T7 RNA聚合酶经体外转录制备的RNA转录本转染猪睾丸细胞系(ST)后,利用G418筛选含有GD53-SGR的ST细胞,构建ST-GD53-SGR细胞系。酶切鉴定及测序结果表明,重组质粒pc DNA-GD53-SGR构建正确,利用T7 RNA聚合酶体外转录后获得了与预期大小一致的GD53-SGR RNA。经RT-PCR和间接免疫荧光鉴定结果表明,获得了含有GD53-SGR的ST细胞系。本研究构建的CSFV ST-GD53-SGR细胞系有助于进一步了解CSFV非结构蛋白的功能,同时为CSFV的复制机制研究及抗病毒药物的研发奠定基础。
- 张莉谢金鑫蒋大良余兴龙贾俊杰郭焕成龚文杰涂长春
- 关键词：猪瘟病毒ST细胞
