宋小双
- 作品数：7 被引量：14H指数：3
- 供职机构：西南大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：重庆市自然科学基金中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程更多>>
- 表达食血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的毕赤酵母菌株的构建被引量：3
- 2009年
- 食血蝙蝠(Desmodus rotundus)在吸食大型动物血液时能保持创口处血流的畅通。本研究根据食血蝙蝠唾液中发现的纤溶酶原激活剂(Bat-PA,另称DSPAα1)的全长基因序列(GenBank Accession No.J05082),首次在体外人工合成Bat-PA全长基因并亚克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K上;转化毕赤酵母菌株GS115后,经甲醇诱导获得DSPAα1的分泌型表达,表达条带为47kD;通过抗G418浓度梯度筛选、毕赤酵母中小量表达后SDS-PAGE电泳检测以及纤维平板法测活,筛选出高表达的DSPAα1稳定菌株,对电泳中的目的蛋白条带进行密度扫描测定,产量达到约30mg/L。目前,DSPAα1主要来自哺乳动物细胞,如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、胚胎卵巢肾细胞(BHK)、非洲绿猴肾细胞(COS),代价高昂。在毕赤酵母中生产DSPAα1可以降低成本,增加产率,为探索Bat-PA作为新一代溶栓剂奠定基础。
- 刘堰苏畅宋小双汤雅岚包振鸿
- 关键词：纤溶酶原激活剂毕赤酵母
- 人白细胞介素-2突变体在大肠杆菌中的克隆表达与鉴定
- 根据 GenBank 上报道的人白细胞介素-2(hIL-2)基因分析设计并合成引物,以 pPIC9K/IL-2 突变体(本实验室构建,编码125位半胱氨酸→丙氨酸;18位亮氨酸→蛋氨酸;19位亮氨酸→丝氨酸)为模板,通过...
- 宋小双刘堰
- 关键词：大肠杆菌表达系统克隆
- 人白细胞介素-2突变体在大肠杆菌中的克隆表达与鉴定被引量：4
- 2009年
- 根据GenBank报道的人白细胞介素-2(hIL-2)基因分析设计并合成引物,以本室构建的pPIC9K/IL-2突变体(编码125位半胱氨酸→丙氨酸、18位亮氨酸→蛋氨酸、19位亮氨酸→丝氨酸)为模板,PCR扩增出突变型人白细胞介素-2基因.用EcoRI和BamHⅠ对目的基因进行双酶切后,插入大肠杆菌表达载体pBV220,转化宿主菌JM109,经菌落PCR筛选阳性重组子、酶切鉴定,DNA序列分析证实,重组质粒pBV220/IL-2含有突变型人IL-2编码序列及正确的开放阅读框.经42℃热诱导表达,SDS-PAGE电泳显示,诱导表达碎菌后的沉淀中有分子质量大小约为15kD的外源蛋白产生,经Western印迹证明为rhIL-2.成功建立了突变型人白细胞介素-2(rhIL-2)基因的大肠杆菌表达系统,为rhIL-2的生产及临床应用奠定基础.
- 宋小双聂盼马永鹏刘堰
- 关键词：大肠杆菌表达系统克隆
- 食血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂在毕赤酵母中的表达方法
- 一种食血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂在毕赤酵母中的表达方法，通过在体外人工合成吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(Bat-PA)的全长基因，再将其克隆到表达载体pPIC9K上，然后通过电穿孔的方法将线性化的重组质粒转化进入酵母细胞，进...
- 刘堰苏畅石小花宋小双聂盼肖明春
- 文献传递
- 毕赤酵母工程菌表达人白细胞介素——2突变体发酵条件的优化被引量：7
- 2008年
- 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌(KM71/pPIC9K-MvhIL-2,本室构建)能分泌表达三突变体人白细胞介素-2(MvhIL-2),突变位点分别为125 Cys→Ala;18leu→Met;19leu→Ser.通过对其发酵条件的研究,探索重组人白细胞介素-2突变体工程菌KM71/pPIC9K-IL-2的生长及产物表达规律,通过3因素(即:发酵液起始pH值、甲醇诱导浓度、诱导时间)从3个不同水平上进行正交试验,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,得出摇瓶发酵表达MvhIL-2的最佳条件:发酵液初始pH 6.0,甲醇诱导浓度为0.5%,诱导72 h,最终使目的产物达到菌体总蛋白的30%以上,表达的MvhIL-2考马斯亮蓝染色条带最明显,为其进一步上发酵罐,大量生产重组人白细胞介素-2奠定了基础.
- 易巧宋小双朱祥伟刘堰
- 关键词：毕赤酵母正交试验
- 食血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂及其缺失突变体的构建、表达及活性研究
- 食血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂,是美国科学家Stephen J.Gardell于1989年从南美洲吸血蝙蝠Desmodus rotundus的唾液中分离获得,是一种组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)类似物。该类似物共有四种形式...
- 宋小双
- 关键词：突变体毕赤酵母新药研发
- DSPAα1缺失突变体在毕赤酵母中的表达及活性研究
- 2016年
- 吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(Desmodus salivary plasminogen activators,DSPAs)共有4种:DSPAα1、α2、β及γ。其中,DSPAα含有指形区(F)、表皮生长因子区(E)、kringle区(K)和丝氨酸蛋白酶区(P),DSPAβ含E、K、P区,DSPAγ含K和P区。以DSPAα1为基础,研究其结构对纤溶活性的影响。采用重叠延伸PCR技术(splicing overlap extension PCR,SOE-PCR)获得缺失E区的DSPAα1突变体(m DSPAα1),分别构建m DSPAα1/p PIC9K、DSPAβ/p PIC9K和DSPAγ/p PIC9K重组质粒并转化到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115中表达,纤维平板法测活。结果显示未检测到DSPAγ的表达,DSPAα1活性为2.64×105 U/mg,DSPAβ的活性为1.32×104 U/mg,m DSPAα1活性为151.52 U/mg;同时使用DSPAα1、m DSPAα1、DSPAβ时,总活性几乎不受影响,单独使用任意两者时,发现活性均降低2-3倍。m DSPAα1纤溶活性几乎没有,同时DSPAβ与野生型DSPAα1相比保留了相当的催化活性。DSPAα1的N端区域可以影响其溶栓活性,而缺失E区后几乎丧失活性,说明E区在DSPAα1溶栓过程中起着至关重要的作用。
- 陈韵牛纯青宋小双苏畅华子春刘堰
- 关键词：SOE-PCR缺失突变体毕赤酵母
