李红乐
- 作品数：10 被引量：69H指数：5
- 供职机构：南方医科大学更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金国家杰出青年科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 带Tat标记质粒载体的构建及其转导融合蛋白进入细胞的研究被引量：10
- 2003年
- 采用点突变技术构建了带 6×His、Tat和Flag多个标记的pET HTF的质粒载体 ,利用基因重组技术构建pET HTF EGFP融合蛋白载体 .酶切和DNA测序证明 ,所构建的pET HTF和pET HTF EGFP载体正确 .BL2 1(DE3)表达融合蛋白 ,用Ni2 + 分离柱纯化His Tat Flag EGFP蛋白 ,并加入培养的NIH3T3细胞 .荧光显微镜观察显示 ,His Tat Flag EGFP融合蛋白进入细胞 .带His、Tat和Flag标记的质粒载体pET 14b HTF表达的融合蛋白能够进入细胞 。
- 孙学刚宋革刘靖华李红乐邢飞跃张丽华秦清和姜勇
- 关键词：质粒载体融合蛋白细胞增强型绿色荧光蛋白蛋白转导
- 人AWP1-RFP融合基因重组腺病毒的快速构建及其鉴定被引量：4
- 2005年
- 目的构建人的AWP1与红色荧光蛋白(RFP)融合基因的重组腺病毒载体,为研究AWP1的生物功能提供工具。方法将克隆的AWP1cDNA插入高效表达RFP的载体pDsRed1-N1的多克隆位点,与RFP序列形成AWP1-RFP融合基因,将该融合基因亚克隆到穿梭载体pAdTrack-CMV和pAdShuttle-CMV中;经酶切鉴定正确后PmeI线形化,与骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183以同源重组;用lipofectAMINE将PacI线形化的同源重组腺病毒载体转染293细胞以包装腺病毒;通过同源重组病毒载体和病毒颗粒基因组的DNA测序及PCR扩增和在293细胞中的表达鉴定重组腺病毒。结果同源重组载体和病毒颗粒的DNA测序和PCR分析显示AWP1cDNA序列正确,感染293细胞获得了AWP1-RFP融合蛋白的高效表达。结论成功构建和包装了人AWP1-RFP融合基因重组腺病毒。
- 曹永宽莫永炎田伏洲邓鹏秦清和邢飞跃李红乐姜勇
- 关键词：红色荧光蛋白重组腺病毒绿色荧光蛋白
- 供者源性的骨髓间质干细胞对急性移植物抗宿主病的影响被引量：18
- 2003年
- 目的 :采用大鼠骨髓移植模型探讨共移植供者源性的骨髓间质干细胞 (MSCs)对骨髓移植后急性移植物抗宿主病 (GVHD)的影响。方法 :体外培养Fisher344大鼠骨髓间质干细胞 ,扩增至第 5代用于移植。建立大鼠异基因急性GVHD模型 (F344→Wistar)。受者Wistar大鼠采用致死性全身照射预处理 ,当天移植F344大鼠骨髓细胞和脾细胞。实验组则移植F344大鼠骨髓细胞、脾细胞和第 5代的MSCs。观察各组移植后急性GVHD的发生时间、发病率和存活时间。结果 :共移植MSCs推迟急性GVHD的发病时间 [( 19 1± 1 7)dvs( 15 6± 1 5 )d ,P <0 0 5 ],延长该组的存活时间 [( 35 6± 7 0 )dvs ( 2 5 4± 6 0 )d ,P <0 0 5 ],但无法完全消除急性GVHD的发生。结论 :MSCs在体内具有免疫抑制功能 ,供者来源的MSCs在不使用免疫抑制剂情况下 。
- 李浩威温冠媚肖庆忠李红乐段连宁项鹏张秀明李树浓
- 关键词：急性移植物抗宿主病骨髓间质干细胞骨髓移植
- BDNF重组腺病毒的构建及在大鼠骨髓间质干细胞的表达被引量：10
- 2003年
- 目的 :利用大肠杆菌细菌内同源重组构建带有增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因的脑源性神经营养因子前体 (proBDNF)和脑源性神经营养因子 (BDNF)重组腺病毒并在大鼠骨髓间质干细胞 (rMSC)高效表达。方法 :采用两步亚克隆的方法将proBDNF和BDNF构建入带有EGFP表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack -CMV中 ,形成转移载体pAdTrack -proBDNF和pAdTrack -BDNF ,采用化学转化法在大肠杆菌BJ5 183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy- 1同源重组 ,得到重组腺病毒载体pAd -proBDNF和pAd -BDNF ;转染 2 93细胞 ,包装成重组病毒颗粒 ;将重组病毒上清感染rMSC ,用荧光显微镜下观察和Western -blotting鉴定重组病毒在rMSC表达 ;用Ad -proBDNF和Ad -BDNF感染的rMSC在体外诱导向神经样细胞分化 ;用Ad -proBDNF和Ad -BDNF的感染的rMSC接种于裸鼠肌肉内 ,两周后荧光显微镜下直接观察。结果 :成功地构建了proBDNF和BDNF重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒 ,重组病毒能在体外培养的rMSC高效表达并不影响其分化潜能 ,体内移植实验表明Ad -proBDNF和Ad -BDNF感染的rMSC能在体内表达。结论 :重组腺病毒具有较高的介导proBDNF和BDNF基因表达于rMSC的效率 ,带有报告基因EGFP的Ad -proBDNF和Ad -BDNF感染的rMSC可以用于体内移植实验。
- 李红乐李浩威邢飞跃孙学刚邓宇斌张秀明姜勇李树浓
- 关键词：BDNF重组腺病毒骨髓间质干细胞增强型绿色荧光蛋白基因融合
- 信号肽-FRET荧光蛋白载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达被引量：1
- 2003年
- 目的构建带TLR4信号肽的增强型青色荧光蛋白(pECFP-C1-SP)和增强型黄色荧光蛋白(pEYFP-C1-SP)的质粒载体,为使用荧光共振能量转移(FRET)技术研究LPS在细胞膜上的受体识别机制提供依据。方法采用点突变技术构建了带TLR4信号肽的载体,用脂质体瞬时转染NIH3T3细胞,观察带信号肽载体和融合蛋白载体在细胞内的表达。结果DNA测序证明所构建的带TLR4信号肽的载体正确;酶切和DNA测序表明融合蛋白载体的构建正确,TLR4信号肽可以使蛋白主要表达在膜上。结论所构建的带信号肽的荧光蛋白载体是正确的,pECFP-C1-SP和pEYFP-C1-SP能够表达在细胞膜上,可有效地应用于膜蛋白相互作用的研究。
- 孙学刚宋革刘靖华安海燕李红乐邢飞跃张丽华姜勇
- 关键词：荧光共振能量转移信号肽细胞膜
- 腺病毒介导的EGFP基因在大鼠骨髓间质干细胞中的高效表达被引量：14
- 2003年
- 目的 :研究复制缺陷型腺病毒感染骨髓间质干细胞介导外源基因表达的可行性及感染效率。方法 :在体外低密度扩增大鼠骨髓间质干细胞 (rMSC) ,用细菌同源重组法构建巨细胞病毒 (CMV)驱动的增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因腺病毒载体 (pAd -EGFP) ,用 2 93包装细胞制备腺病毒 ,用EGFP重组腺病毒感染rMSC ,观察重组腺病毒携带基因在MSC中的感染和表达情况 ,用细胞计数法和流式细胞仪分析感染效率。用血清撤离加入 β -巯基乙醇诱导Ad -EGFP感染的rMSC向神经样细胞定向分化。结果 :Ad -EGFP可高效感染rMSC ,感染率为 (3 6±2 ) % ,而脂质体法转染质粒pTrack -GFP在rMSC转染效率非常低且不易成功 ;Ad -EGFP感染后的不同扩增代数的rMSC在受到 β -巯基乙醇的诱导分化后在荧光显微镜下呈典型的突触形式。免疫组化鉴定发现这些诱导细胞表达神经元特异烯醇化酶 (NSE) ,表明腺病毒介导外源基因转染后rMSC仍具有分化为神经样细胞的潜能。结论 :腺病毒载体具有较高的介导外源基因表达于rMSC的效率 。
- 李红乐邢飞跃孙学刚曹永宽宋革张秀明姜勇李树浓
- 关键词：EGFP基因骨髓间质干细胞腺病毒感染
- 应用细菌同源重组法快速构建和制备重组腺病毒被引量：12
- 2002年
- 目的 :利用大肠杆菌细菌同源重组构建重组腺病毒载体并在 2 93细胞制备高滴度重组病毒。方法 :自细胞周期相关激酶真核表达载体pCR3 1 -CCRK中酶切出CCRK基因 ,亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack -CMV中 ,形成转移质粒pAdTrack -CMV -CCRK ,采用电穿孔或化学转化法在大肠杆菌BJ51 83内与腺病毒骨架质粒pAdEasy - 1同源重组 ,得到重组腺病毒载体pAd -CCRK。以pAd -CCRK为模板 ,经DNA测序正确后 ,用PacI酶切线性化pAd -CCRK ,转染 2 93细胞 ,包装成重组病毒颗粒 ,荧光显微镜观察转染细胞EGFP的表达 ,采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定。将重组病毒上清感染RAW细胞 ,荧光显微镜下观察感染细胞重组病毒的表达。结果 :成功地构建了携带CCRK基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒 ,重组病毒能在体外高效表达。结论 :应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体 ,可高效制备均一的高滴度重组病毒 。
- 李红乐秦清和王静珍邓鹏李树浓姜勇
- 关键词：腺病毒同源重组荧光蛋白细菌
- 人eNOS启动子不同序列驱动的红色荧光蛋白载体的构建与表达被引量：2
- 2003年
- 目的 :为了研究人血管内皮细胞一氧化氮合酶 (eNOS)启动子的功能 ,构建在哺乳动物细胞中表达的人eNOS启动子不同区段驱动的红色荧光蛋白报告基因载体。方法 :从重组pDseNOSRed载体上将eNOS启动子的不同长度DNA序列亚克隆至红色荧光蛋白载体pDsRed1 - 1上 ,经PCR、酶切和DNA测序鉴定 ,将重组载体pDsF1 0 33Red ,pDsF494Red和pDsF1 66Red转染NIH3T3细胞 ,在倒置荧光显微镜下观察它们在细胞内的表达情况。结果 :PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组载体pDsF1 0 33Red ,pDsF494Red和pDsF1 66Red的构建正确 ,这些载体能在NIH3T3细胞中有效表达。由eNOS启动子不同区段驱动表达的 95 %以上的红色荧光蛋白均匀分布于整个细胞 ,转染后 48- 60h开始出现 ,96 - 1 4 4h为红色荧光蛋白 (RFP)的表达高峰 ,RFP的荧光在 1 4 4h最强 ,1 68h后红色荧光逐渐消退 ,2 1d后仍有很少量红色荧光残留。RFP的表达量和荧光强度明显低于强启动子pCMVIE驱动的RFP。结论 :成功构建了eNOS启动子不同区段驱动的红色荧光蛋白报告基因载体 ,它们能在哺乳动物细胞中有效表达 ,静息状态下呈现弱转录活性 。
- 邢飞跃赵克森李红乐孙学刚秦清和王静珍邓鹏龚小卫姜勇
- 关键词：一氧化氮合酶启动子红色荧光蛋白基因表达
- 腺病毒介导的基因在大鼠间质干细胞的转移及分化为神经样细胞的信号机制研究
- 全文包括三个部分:第一部分:体外分离和扩增SD大鼠骨髓MSC,分析细胞接种密度对其增殖能力的影响,MSC细胞表型的鉴定、MSC超微结构的观察.第二部分:利用细菌内同源重组的方法构建EGFP(enhanced green ...
- 李红乐
- 关键词：骨髓间质干细胞腺病毒丝裂原活化蛋白激酶同源重组
- 文献传递
- 人eNOS启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体构建与表达被引量：1
- 2002年
- 目的研究血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)启动子的功能和eNOS基因表达的调控机制 ,利用红色荧光蛋白构建在哺乳动物细胞中表达的人eNOS启动子全长及其不同区段DNA序列驱动的红色荧光蛋白报告基因载体 ,并对它们在哺乳动物细胞的表达规律作了观察。方法从人脐静脉内皮细胞基因组DNA中克隆eNOS启动子全长( -1～ -1600bp)基因序列(GenBandTM,AccessionNumbe:AF387340)将其构建到红色荧光蛋白载体pDsRed1 -1上 ,经PCR、酶切和DNA测序鉴定正确后命名为pDse_NOSRed。然后以重组pDseNOSRed载体为模板 ,通过DNA序列删除法将eNOS启动子的不同区段DNA序列亚克隆至红色荧光蛋白载体pDsRed1 -1上。这些区段分别是F1033 ,主要删除AP1( -1524～ -1530)、SRE1( -1379～ -1385)和AP2( -1155～ -1163)元件 ;F494 ,主要删除SSRE( -994～ -1000)、AP1( -656～ -662)和RCE( -857～ -863,-812～ -817 ,-711～ -716)元件 ;F166 ,主要删除CACCC( -366～ -370)和GATA( -226～ -231)元件 ,并保留SP1( -95～ -104)元件。所用上游引物分别为5' -gaagatctatctgatgctgcctgtcaccttgaccctgag-3',5'-ccagatctccgtttctttcttaaact_3'、5'_cgagatctgaggtgaaggagagaac_3'和5'_caagatctgtggagctgaggcttt_3',均含有Bg1Ⅱ酶切位点(黑体和下线所?
- 邢飞跃赵克森孙学刚李红乐秦清和王静珍邓鹏龚小卫姜勇
- 关键词：基因载体基因表达
