胡叶
- 作品数：6 被引量：35H指数：5
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- RhoA和血清反应因子(SRF)介导E1A激活基因阻遏子诱导人血管平滑肌细胞分化被引量：10
- 2006年
- 为探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)对人血管平滑肌细胞(VSMCs)分化的调控机制,应用重组逆转录病毒表达载体pLNCX2(+)/CREG及pLXSN(-)/CREG制备稳定感染HITASY细胞模型,观察CREG蛋白过表达及表达抑制对人VSMCs分化的影响并探讨其调控机制.结果显示:pLNCX2(+)/CREG稳定感染细胞呈分化表型,细胞细长变成组织样聚集生长趋势,细胞中CREG蛋白和平滑肌分化标志蛋白平滑肌α-肌动蛋白(SMα-actin)表达显著增加,同时SMα-actin相关调控因子——血清反应因子(SRF)入核转位,RhoA总蛋白表达上调,以Rho激酶特异性抑制剂Y-27632作用后,CREG诱导的SMα-actin表达下调的同时SRF出核转位;pLXSN(-)/CREG稳定感染的细胞体积变大,细胞极性消失,呈无序生长,细胞中CREG和SMα-actin蛋白表达显著降低,同时伴有SRF出核转位及RhoA总蛋白表达下调.免疫共沉淀分析发现,CREG蛋白能被分泌到VSMCs培养基中表达,并可与细胞膜受体6-磷酸甘露糖/胰岛素样生长因子Ⅱ型受体(M6P/IGF2R)发生直接相互作用.用蛋白磷酸酶PP2A特异性抑制剂okadaicacid减少M6P/IGF2R在细胞膜表面分布,可明显抑制CREG过表达引起的RhoA、SRF和SMα-actin表达.上述结果提示,在体外培养的人VSMCs中,CREG可能作为一种分泌型蛋白质通过与细胞膜受体M6P/IGF2R相互作用,依次激活SMα-actin蛋白相关调控因子RhoA和SRF引起SMα-actin表达增加,促进VSMCs向分化表型转换.
- 韩雅玲徐红梅闫承慧胡叶康建刘海伟
- 关键词：阻遏蛋白E1A
- E1A激活基因阻遏子过表达抑制体外人血管平滑肌细胞凋亡被引量：12
- 2006年
- 为探讨EIA激活基因阻遏子(cellular repressor of EIA-stimulated genes,CREG)对人血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)凋亡的影响及调控机制,应用正、反义重组逆转录病毒表达载体pLNCX_2(+)/CREG及pLXSN(-)/CREG制备稳定感染人胸廓内动脉平滑肌细胞克隆株(human internal thoracic artery-Shenyang,HITASY)细胞模型．观察CREG蛋白过表达及表达抑制对平滑肌细胞凋亡的影响。荧光显微镜下观察DAPI染色后凋亡细胞核形态,Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR技术分析凋亡相关基因caspase-9mRNA的表达,蛋白质印迹法分析p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)、磷酸化p38 MAPK(phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase,p-p38 MAPK)的表达变化。研究结果显示,CREG蛋白过表达明显抑制血清饥饿诱导的HITASY细胞凋亡的发生；同时细胞中p38 MAPK、p-p38 MAPK的表达增加。相反,抑制CREG蛋白表达则引起正常血清培养状态下VSMCs的自发凋亡明显增加,同时细胞内p38 MAPK、p-p38 MAPK表达显著下降。进一步研究发现,预先应用特异性抑制剂SB203580阻断p38 MAPK信号转导通路后,CREG蛋白过表达引起的细胞凋亡抑制作用被明显减弱,血清饥饿后CREG蛋白过表达引起的HITASY细胞凋亡现象明显增加。上述结果提示,CREG蛋白过表达可以抑制体外培养的VSMCs凋亡．p38 MAPK信号转导通路可能介导CREG蛋白对VSMCs凋亡的抑制作用。
- 韩雅玲徐红梅邓捷胡叶康建刘海伟闫承慧
- 关键词：阻遏蛋白凋亡细胞血管平滑肌
- E1A激活基因阻遏子促进人血管平滑肌细胞分化和迁移被引量：13
- 2005年
- 为探讨E1A激活基因阻遏子(cellularrepressorofE1A-stimulatedgenes,CREG)蛋白在人血管平滑肌细胞株HITASY分化和迁移中的调控作用,构建了重组逆转录病毒载体pLNCX2(+)/CREG和pLXSN(-)/CREG.以带绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的空载体pLNCX(+)/GFP和正常HITASY为对照,用磷酸钙共沉淀法将重组逆转录病毒载体转染293细胞,包装出完整的逆转录病毒后,感染HITASY.经G418筛选,获得稳定感染的细胞克隆.应用免疫荧光染色、蛋白质印迹等方法检测CREG和平滑肌分化标志蛋白α-肌动蛋白(SMα-actin)表达,同时通过刮伤实验、慢速显微摄像技术检测细胞迁移能力以及用明胶酶谱方法分析细胞基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMPs)的活性.结果表明:pLNCX2(+)/CREG稳定感染的HITASY中CREG和SMα-actin蛋白表达上调,MMP-2和MMP-9活性升高,细胞迁移速度加快;pLXSN(-)/CREG稳定感染的HITASY中CREG和SMα-actin蛋白表达下调,MMP-2和MMP-9活性降低,细胞迁移速度减慢.上述研究提示CREG在诱导血管平滑肌细胞分化的同时促进细胞迁移.
- 韩雅玲胡叶刘海伟康建闫承慧李少华
- 关键词：分化迁移逆转录病毒载体平滑肌
- E1A激活基因阻遏子过表达诱导体外培养大鼠平滑肌细胞分化被引量：16
- 2004年
- 为探讨E1A激活基因阻遏子蛋白 (CREG)对血管平滑肌细胞表型转换的调控机制 ,应用pRC/CMV hCREG真核表达载体转染体外培养的大鼠血管平滑肌细胞 (VSMCs) ,观察了转染前后细胞的表型改变 .结果发现 ,pRC/CMV hCREG质粒转染后 ,大鼠平滑肌细胞增殖受抑 ,细胞分化标志蛋白SMα actin表达显著增加 .免疫共沉淀分析发现 ,CREG与血清反应因子 (SRF)发生相互作用形成复合体 ,在CREG基因过表达时 ,与CREG结合的SRF蛋白增加 .凝胶迁移阻滞分析 (GSMA)和抗体凝胶迁移阻滞分析 (supershift)显示 ,过表达的CREG蛋白与SRF蛋白共同结合到SMα actin基因启动子区CArG位点上 ,可能参与SMα actin表达的调控 .构建SMα actinpromoter pCAT 3报告基因载体并与pRC/CMV hCREG质粒共转染VSMCs也证实 ,CREG蛋白过表达可增强SMα actin基因表达 .上述研究提示 。
- 韩雅玲闫承慧刘海伟胡叶康建王效增李少华
- E1A激活基因阻遏子促进入血管平滑肌细胞分化和迁移
- 目的目前认为VSMCs增殖与迁移是导致动脉粥样硬化和血运重建后再狭窄等增生性血管病的重要机制,而血管损伤后VSMCs表型转换是其增殖和迁移的始动因素。为探讨CREG蛋白在人血管平滑肌细胞株HITASY分化和迁移中的调控作...
- 韩雅玲胡叶刘海伟康建闫承慧李少华
- 文献传递
- 人E1A激活基因阻遏子的表达、抗体制备及生物学活性分析被引量：6
- 2005年
- 目的:构建人E1A激活基因阻遏子(humancellularrepressorofE1A-stimulatedgene,hCREG)基因的原核表达载体,纯化重组的hCREG融合蛋白并制备兔抗hCREG抗体。探讨hCREG蛋白在人血管平滑肌细胞克隆株(HITASY)中的表达、定位。方法:用PCR技术,扩增hCREG并构建pGEX-4T-1/hCREG原核表达载体。诱导表达重组谷胱甘肽巯基转移酶(glutathioneS-transferase,GST)-hCREG融合蛋白。以GST-hCREG为抗原,制备兔抗人GST-hCREG的抗血清,并通过蛋白A和GST亲和层析纯化。用ELISA和Westernblot法检测抗体的效价和特异性;用免疫荧光染色法检查去血清培养前后HITASY细胞中hCREG蛋白的表达及定位;用BrdU染色观察分泌型hCREG蛋白对HITASY细胞增殖的影响。结果:经鉴定证实构建的重组质粒正确。诱导后pGEX-4T-1/hCREG菌株可表达大量的GST-hCREG融合蛋白,层析纯化后其纯度达90%。Westernblot检测表明,纯化的兔抗hCREG抗体可与hCREG蛋白特异性结合。ELISA测得该抗体的效价>1∶105。免疫荧光染色检测显示,去血清培养诱导的HITA-SY细胞中hCREG蛋白的表达增加且定位在核周围。BrdU染色表明,hCREG可明显抑制HITASY细胞增殖。结论:成功地获得兔抗hCREG抗体。证实去血清培养的血管平滑肌细胞中CREG蛋白的表达上调。表达的hCREG蛋白可抑制HI-TASY细胞增殖,提示hCREG可能参与调控血管平滑肌细胞的增殖与分化。
- 韩雅玲刘海伟闫承慧康建王效增胡叶
- 关键词：纯化抗体血管平滑肌细胞
