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RhoA和血清反应因子(SRF)介导E1A激活基因阻遏子诱导人血管平滑肌细胞分化被引量：10: 2006年; 为探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)对人血管平滑肌细胞(VSMCs)分化的调控机制,应用重组逆转录病毒表达载体pLNCX2(+)/CREG及pLXSN(-)/CREG制备稳定感染HITASY细胞模型,观察CREG蛋白过表达及表达抑制对人VSMCs分化的影响并探讨其调控机制.结果显示:pLNCX2(+)/CREG稳定感染细胞呈分化表型,细胞细长变成组织样聚集生长趋势,细胞中CREG蛋白和平滑肌分化标志蛋白平滑肌α-肌动蛋白(SMα-actin)表达显著增加,同时SMα-actin相关调控因子——血清反应因子(SRF)入核转位,RhoA总蛋白表达上调,以Rho激酶特异性抑制剂Y-27632作用后,CREG诱导的SMα-actin表达下调的同时SRF出核转位;pLXSN(-)/CREG稳定感染的细胞体积变大,细胞极性消失,呈无序生长,细胞中CREG和SMα-actin蛋白表达显著降低,同时伴有SRF出核转位及RhoA总蛋白表达下调.免疫共沉淀分析发现,CREG蛋白能被分泌到VSMCs培养基中表达,并可与细胞膜受体6-磷酸甘露糖/胰岛素样生长因子Ⅱ型受体(M6P/IGF2R)发生直接相互作用.用蛋白磷酸酶PP2A特异性抑制剂okadaicacid减少M6P/IGF2R在细胞膜表面分布,可明显抑制CREG过表达引起的RhoA、SRF和SMα-actin表达.上述结果提示,在体外培养的人VSMCs中,CREG可能作为一种分泌型蛋白质通过与细胞膜受体M6P/IGF2R相互作用,依次激活SMα-actin蛋白相关调控因子RhoA和SRF引起SMα-actin表达增加,促进VSMCs向分化表型转换.; 韩雅玲徐红梅闫承慧胡叶康建刘海伟; 关键词：阻遏蛋白 E1A

逆转录病毒介导E1A激活基因阻遏子过表达抑制颈动脉球囊损伤大鼠新生内膜形成: 目的经皮冠状动脉介入术(PCI)后再狭窄(restenosis,RS)的发生是目前心血管病介入治疗研究的重要课题。血管损伤后平滑肌细胞(SMC)由分化表型向增殖表型的转换则是新生内膜形成的重要始动因素。 E1A激活基因阻...; 邓捷韩雅玲梁明康建刘海伟徐红梅闫承慧; 文献传递

逆转录病毒介导E1A激活基因阻遏子过表达抑制颈动脉球囊损伤大鼠新生内膜形成: 目的观察E1A激活基因阻遏子（CREG）在血管平滑肌细胞表型转换过程中的调控作用及对损伤血管内膜增生的影响。方法重组逆转录病毒介导pLNCX-CREG和pLNCX-GFP分别感染体外培养血管平滑肌细胞。同时建立大鼠颈动脉...; 邓捷韩雅玲康建闫承慧刘海伟徐红梅; 文献传递

RhoA和SRF介导E1A激活基因阻遏子诱导人血管平滑肌细胞分化: 目的 E1A激活基因阻遏子(CREG)是本研究室应用差异显示PCR技术在体外培养的分化表型人血管平滑肌细胞(VSMCs)克隆株HITASY细胞中筛选到的高表达差异性基因,进一步系列研究发现,CREG基因表达与HITASY...; 徐红梅韩雅玲胡叶康建刘海伟闫承慧; 文献传递

人CREG基因启动子报告基因载体的克隆及其调控序列的研究: 目的构建hCREG启动子报告基因载体,用以进一步检测与hCREG基因启动子区相互作用的转录调控因子,明确转录因子在VSMCs表型转化中的作用及其对hCREG表达调控的分子机制。方法应用生物信息学方法定位hCREG基因启动...; 赵昕韩雅玲闫承慧康建张效林邓捷徐红梅刘海伟; 文献传递

E1A激活基因阻遏子过表达抑制体外人血管平滑肌细胞凋亡被引量：12: 2006年; 为探讨EIA激活基因阻遏子(cellular repressor of EIA-stimulated genes,CREG)对人血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)凋亡的影响及调控机制,应用正、反义重组逆转录病毒表达载体pLNCX_2(+)/CREG及pLXSN(-)/CREG制备稳定感染人胸廓内动脉平滑肌细胞克隆株(human internal thoracic artery-Shenyang,HITASY)细胞模型．观察CREG蛋白过表达及表达抑制对平滑肌细胞凋亡的影响。荧光显微镜下观察DAPI染色后凋亡细胞核形态,Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR技术分析凋亡相关基因caspase-9mRNA的表达,蛋白质印迹法分析p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)、磷酸化p38 MAPK(phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase,p-p38 MAPK)的表达变化。研究结果显示,CREG蛋白过表达明显抑制血清饥饿诱导的HITASY细胞凋亡的发生；同时细胞中p38 MAPK、p-p38 MAPK的表达增加。相反,抑制CREG蛋白表达则引起正常血清培养状态下VSMCs的自发凋亡明显增加,同时细胞内p38 MAPK、p-p38 MAPK表达显著下降。进一步研究发现,预先应用特异性抑制剂SB203580阻断p38 MAPK信号转导通路后,CREG蛋白过表达引起的细胞凋亡抑制作用被明显减弱,血清饥饿后CREG蛋白过表达引起的HITASY细胞凋亡现象明显增加。上述结果提示,CREG蛋白过表达可以抑制体外培养的VSMCs凋亡．p38 MAPK信号转导通路可能介导CREG蛋白对VSMCs凋亡的抑制作用。; 韩雅玲徐红梅邓捷胡叶康建刘海伟闫承慧; 关键词：阻遏蛋白凋亡细胞血管平滑肌

人血管细胞中hCREG1基因启动子对血清饥饿发生应答: 2008年; 目的:为揭示E1A激活基因阻遏子(CREG1)在人血管平滑肌细胞(VSMCs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中表达的调控机制,构建人CREG1(hCREG1)启动子报告基因载体,探讨CREG1在不同血管细胞中的表达。方法:在对hCREG1进行生物信息学分析的基础上,以人基因组DNA为模板,PCR方法扩增含有hCREG1基因上游-3677bp序列,构建了hCREG15′上游-3677bp、-2310bp和-945bp序列片段,分别将这3个序列克隆到pMD18-T载体上并定向亚克隆到pEGFP-1报告基因载体-pEGFP-hCREG1-P3677、pEGFP-hCREG1-P2310和pEGFP-hCREG1-P945。将重组质粒瞬时转染VSMCs株HITASY和HUVECs,检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达。结果:经测序鉴定证实,3个报告基因载体中插入的PCR扩增序列均与hCREG1基因上游DNA序列完全匹配。瞬时转染体外培养的人VSMCs和HUVECs后,经荧光观察和蛋白质印迹(Western blotting)证实,细胞内存在GFP的表达,并且0.5%FBS培养的HITASY细胞中GFP表达较10%FBS培养的细胞中明显增加。HU-VECs中的GFP表达较人VSMCs明显增加。结论:hCREG1基因启动子报告基因载体构建成功,核心启动子存在于5′上游序列的-945bp-0bp区域,为进一步研究hCREG1基因表达提供了条件。; 韩雅玲赵昕闫承慧康建张效林邓捷徐红梅刘海伟; 关键词：基因

人E1A激活基因阻遏子基因启动子生物信息学分析及转录调控功能初探: 2007年; 目的对人类腺病毒5型早期区域1A(adenovirus type 5 early region 1A,E1A)激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A-stimulated genes,hCREG)启动子进行生物信息学分析、预测hCREG启动子位置和转录因子结合位点。方法对2005年1月至7月沈阳军区总医院全军心血管病研究所进行的从Genbank中获得hCREG的全长编码基因,利用First EF程序分析软件分析并获得hCREG的启动子序列,利用Motif软件对启动子序列中的转录因子结合位点进行预测。免疫荧光染色和Western blot分别观察相关转录因子的蛋白表达与细胞内hCREG蛋白及细胞表型转化之间的关系。结果用First EF软件测定长度为945bp的hCREG启动子序列,hCREG的启动子区可能定位于转录起始点上游-109^-359bp。用Motif软件预测启动子区域共含有80多个转录调控因子结合位点,其中肿瘤抑制基因wtp53结合位点为-456bp。进一步应用蛋白质印迹(western blot)和免疫荧光染色分析wtp53与细胞表型转化的关系。在0.5%胎牛血清(fetalbovine serum,FBS)培养的HITASY细胞wtp53表达较10%FBS培养HITASY细胞明显增加。同时,hCREG蛋白和平滑肌细胞分化标志蛋白SMα-ac-tin亦表达增多。结论获得了hCREG启动子的转录调控信息,推测出wtp53是hCREG基因转录的重要调控因子,它可能结合于hCREG启动子区,参与hCREG蛋白对VSMCs表型转化的调控。; 韩雅玲赵昕闫承慧康建张效林邓捷徐红梅刘海伟; 关键词：启动子 WTP53 阻遏蛋白 E1A

逆转录病毒介导的E1A激活基因阻遏子抑制大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜形成被引量：6: 2007年; 目的:探讨逆转录病毒介导的E1A激活基因阻遇子(CREG)过表达对球囊损伤后大鼠颈动脉新生内膜形成的影响。方法:以球囊拉伤法制备大鼠颈动脉损伤模型,应用Pluronic F127胶分别包裹含有pLNCX/CREG、pLNCX/GFP载体的逆转录病毒,并于损伤即刻涂抹于血管外壁。随后在损伤不同时点取出损伤动脉,测量内膜面积及内膜/中膜面积比。用免疫组织化学法观察CREG、SMα-actin及Ki-67变化,Western blotting检测CREG蛋白表达。结果:血管损伤后2 d pLNCX/GFP组血管中膜平滑肌层GFP表达。pLNCX/CREG组大鼠血管CREG表达明显多于单纯损伤组。感染CREG组大鼠球囊损伤后血管新生内膜的形成明显受抑,Ki-67蛋白表达明显少于、而SMα-actin表达则明显多于单纯损伤组。结论:CREG过表达能抑制血管损伤后平滑肌细胞的增殖并促进其分化,提示调控CREG基因的表达可能为预防PCI术后再狭窄提供有效手段。; 韩雅玲邓捷梁明康建刘海伟徐红梅闫承慧; 关键词：血管

转录因子E2F1抑制CREG表达调控体外培养的人血管平滑肌细胞分化被引量：7: 2007年; 为探讨转录因子E2F1在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型转化中的作用及其对E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)表达调控的分子机制,应用生物信息学方法,定位人CREG(hCREG)基因启动子并确定转录因子E2F1在hCREG启动子区的结合位点,PCR方法克隆并构建hCREG基因启动子绿色荧光报告基因载体,以hCREG启动子区E2F1结合位点为模板,化学合成E2F1寡聚脱氧核苷酸(ODN)和错配E2F1ODN,利用转录因子"诱骗(Decoy)"策略,用E2F1ODN转染体外培养的VSMCs以阻断E2F1与hCREG基因启动子区的结合,蛋白质印迹(Western blot)分析检测阻断前后细胞内hCREG蛋白、报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和平滑肌细胞分化标志蛋白SMα-actin表达变化.结果显示:分化表型HITASY细胞中E2F1表达下调伴出核转位,而增殖表型的HITASY细胞中E2F1蛋白表达明显增加且定位于核内.进一步应用FuGene6瞬时转染E2F1ODN和错配E2F1ODN于体外培养HITASY细胞中,蛋白质印迹分析发现,转染E2F1ODN后,HITASY细胞中hCREG、SMα-actin和GFP表达均较未阻断组及错配组细胞明显增加.上述研究结果证实,E2F1是hCREG基因转录的重要调控因子,能够直接结合于hCREG启动子区阻遏hCREG表达,参与hCREG蛋白对VSMCs表型转化的调控作用.; 韩雅玲赵昕闫承慧康建张效林邓捷徐红梅刘海伟; 关键词：E2F1 阻遏蛋白 E1A 表型血管平滑肌细胞

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徐红梅

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