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H7N9禽流感DNA疫苗的免疫保护效力研究被引量：4: 2019年; 为检测H7N9禽流感病毒(AIV) DNA疫苗的免疫保护效力,本研究将H7N9禽流感疫苗株A/Chicken/Guangxi/SD098/2017 (H7N9)[CK/GX/SD098/17 (H7N9)]的HA基因密码子优化后,定向克隆至载体pCAGGS中构建重组质粒pCA-SD098。将pCA-SD098转染至293T细胞后,采用间接免疫荧光(IFA)和western blot检测,结果显示,HA蛋白可以在293T细胞中正确表达。分别利用15μg和20μg重组质粒pCA-SD098免疫3周龄SPF鸡,3周后以相同的剂量和方式加强免疫,加强免疫一周后通过鼻腔分别感染105EID50的同源高致病性AIV (HPAIV)CK/GX/SD098/17 (H7N9)和异源低致病性AIV (LPAIV) A/Chicken/Chongqing/SD057/2017 (H7N9)[CK/CQ/SD057/17 (H7N9)],攻毒10 d内记录免疫鸡发病和死亡情况,检测免疫鸡HI抗体水平,并于攻毒后第3 d、第5 d和第7 d无菌采集所有鸡的喉头和泄殖腔拭子,采用红细胞凝集试验(HA)检测病毒的滴度。结果显示,重组质粒pCA-SD098免疫后可以诱导SPF鸡产生较高水平的HI抗体,15μg pCA-SD098剂量免疫鸡后能够完全抵御H7N9 HPAIV的致死性攻击,20μg pCA-SD098剂量可以有效阻断H7N9 LPAIV的感染。攻毒后,所有免疫鸡无发病、无死亡、无排毒,本研究为质粒pCA-SD098作为防控H7N9禽流感的候选DNA疫苗提供了实验依据。; 梁真洁潘俊慧于晓菲陈普成曾显营柳金雄施建忠邓国华姜永萍陈化兰; 关键词：DNA疫苗免疫保护效力

鸡肠Remak神经显微形态学研究被引量：2: 2008年; 肠Remak神经(Intestinal nerve of Remak,INR)是禽类特有的一条神经节链。取鸡INR制备冰冻切片并将切片分别进行苏木精-伊红和甲苯胺蓝染色。在光镜下观察INR内神经元的形态,统计神经元的数量,测量神经元的面积并用SPSS软件对数据进行分析。通过观察发现,不同肠段INR内神经元的形态存在差异。数量统计显示INR神经节内包含大量的神经元胞体,每只鸡的INR内神经元的总数平均为31821个,并且直肠段INR内的细胞数量最多,为27109个。空肠段INR内神经元的平均面积最大,达到478.46μm2,面积较大的神经元所占的比例也最高;而直肠段INR内单个神经元的平均面积最小,约为391.74μm2。可以推测不同段INR中神经细胞的形态、大小和数量具有一定差异,这种差异可能与其对胃肠道功能的调节有关。; 冯亚玫柳金雄陈秋生

禽流感DNA疫苗(H5亚型,pH5-GD)对AA肉鸡免疫程序的研究: 将禽流感DNA疫苗(H5亚型,pH5-GD)对AA肉鸡的免疫程序进行了研究.将批号为2009001的DNA疫苗分别以0.2 mL(30μg)和0.2 mL(60μg)剂量免疫2周龄AA肉鸡,分别在免疫后7d、14d、28...; 姜永萍王国俊李俊平柳金雄陈普成曾显营陈化兰; 关键词：肉鸡 H5亚型禽流感免疫程序; 文献传递

鸭肠炎病毒疫苗株UL41和UL40基因间隔区作为其复制非必需区的鉴定: 2022年; 为探寻鸭肠炎病毒(DEV)基因组中可插入外源基因的复制非必需区,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建重组质粒pX459-ul4140和含有红色荧光蛋白(RFP)表达框架的穿梭片段UL41-RFP-UL40,转染后拯救重组病毒,并对其进行噬斑纯化。通过PCR和荧光显微镜观察对重组病毒进行鉴定,结果显示,经拯救得到表达RFP的重组病毒rDEV-ul4140RFP;所有代次的rDEV-ul4140RFP在显微镜下均能观察到红色荧光,表明重组病毒中的RFP基因稳定存在。将rDEV-ul4140RFP和亲本病毒DEV疫苗株接种鸡胚成纤维细胞(CEFs)后,收集24 h、48 h、72 h、96 h的细胞和上清,检测TCID并绘制生长曲线。结果显示,rDEV-ul4140RFP在CEF中的生长曲线和亲本DEV疫苗株无显著差异。利用SPF鸭对rDEV-ul4140RFP的免疫保护效果进行评价。攻毒保护实验结果显示,rDEV-ul4140RFP和亲本病毒DEV疫苗株均能对SPF鸭提供100%的免疫保护。本研究结果证实DEV基因组UL41和UL40基因间隔区可作为外源基因的插入位点,为以DEV为载体构建相关重组疫苗提供参考依据。; 刘静赵玉博焦晨晨陈普成胡玉珍姜永萍陈化兰柳金雄; 关键词：鸭肠炎病毒

用于构建双价禽流感DNA疫苗的双目的基因表达质粒的构建及鉴定被引量：3: 2016年; 为探索构建禽流感双价或多价DNA疫苗的可行性,本研究以本实验室前期研制的禽流感DNA疫苗p CAGGopti HA5为基础[其中含有禽流感病毒(AIV)A/Goose/Guang Dong/1/96(H5N1)的HA基因],将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因作为第二个目的基因,利用双启动子启动、内部核糖体进入位点(IRES)介导以及通过蛋白Linker编码序列连接融合表达两个目的基因的形式,构建了双启动子重组表达质粒pH5-eGFP、IRES介导的重组表达质粒pHIE以及融合表达重组质粒pH6E。并采用脂质体介导将这3种重组质粒分别转染293T细胞,通过间接免疫荧光试验和western blot方法检测HA和eGFP这两种目的蛋白的瞬时表达情况。结果显示,这3种重组质粒均能够正确表达AIV的HA蛋白和eGFP。其中pH5-eGFP表达出两个独立的目的蛋白,而且互相不影响各自的表达和细胞定位;pH6E则以融合形式表达两种目的蛋白,由于HA蛋白具有膜定位信号,所以融合蛋白主要定位于细胞膜上。本研究结果表明,双启动子表达质粒和双目的蛋白融合表达质粒适合用于构建AIV以及其他相关病原的双价DNA疫苗。; 黄冬陈普成刘兵唐猛柳金雄姜永萍陈化兰; 关键词：DNA疫苗 EGFP

表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建被引量：7: 2014年; 为构建表达传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(rHVT-VP2),本研究利用RT-PCR方法扩增IBDV的VP2基因构建了重组真核表达质粒pCAGG-VP2,并采用限制性内切酶将携带Pec复合启动子和CMV增强子的VP2基因表达盒(Pec-VP2)切下,连接于Gateway系统入门质粒pENTR构建pENTR-VP2。采用Gateway LR克隆技术将pENTR-VP2与构建的重组粘粒f5354ccdBK+共同参与基因片段互换反应,构建重组粘粒f5354-VP2。f5354-VP2与其他4个相互重叠覆盖HVT全基因组的粘粒经酶切线性化后共同转染CEF细胞,并拯救出重组病毒rHVT-VP2。将重组病毒在CEF细胞中连续传代20次,每隔5代采用PCR、western blot和间接免疫荧光进行检测,结果表明VP2蛋白均得到稳定地表达。rHVT-VP2的构建为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。; 李奇蒙陈普成柳金雄姜永萍王笑梅田雨胡永浩陈化兰; 关键词：传染性法氏囊病毒火鸡疱疹病毒 VP2

表达H5亚型禽流感病毒不同形式HA基因重组鸭瘟病毒的构建及HA表达形式的鉴定被引量：2: 2016年; 为研究禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的信号肽以及跨膜区对HA蛋白在重组病毒中表达的影响,本研究以鸭瘟病毒(DEV)为载体,在DEV基因组的US7和US8基因之间通过同源重组插入去除信号肽或跨膜区的H5N1亚型AIV HA基因编码序列,分别构建了缺失信号肽HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PK)和缺失跨膜区HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PSM),并传至20代,经PCR对插入的外源基因编码序列扩增及序列测定,表明外源基因能够在重组病毒基因组中稳定存在;间接免疫荧光和western blot鉴定结果表明去除信号肽的HA蛋白能够在重组病毒感染的鸡胚成纤维细胞浆中正确表达,而去除跨膜区的HA蛋白能够在感染细胞的培养液中检测到。本研究为表达H5N1亚型AIV HA基因重组DEV载体弱毒疫苗在鸭体内免疫机制的进一步研究奠定基础。; 刘璐丁蕾蕾柳金雄陈普成李爱心胡玉珍姜永萍陈化兰孙晓林; 关键词：禽流感病毒 HA蛋白信号肽跨膜区

鸡肠Remak神经超微结构及其递质的研究: 哺乳动物的肠神经系统/(ENS/)分布在肠壁中，是自主神经系统的第三个组成部分，能独立完成各种反射活动。与哺乳动物不同，禽类由于有肠Remak神经/(INR/)的存在，其ENS不仅包括肠壁内的神经结构，还包括肠壁外的IN...; 柳金雄; 关键词：超微结构胆碱乙酰转移酶血管活性肠肽生长抑素脑啡肽原位杂交; 文献传递

SPF鸡各组织中流感病毒唾液酸受体的分布被引量：2: 2015年; 为了解SPF鸡体内各组织中流感病毒唾液酸受体分布状况,本研究采用凝集素免疫荧光组织染色的方法,系统检测了流感病毒唾液酸受体在SPF鸡呼吸系统、消化系统以及其它系统各组织中的分布,并进行半定量分析。结果表明,大部分组织中均同时存在唾液酸α2,3-半乳糖受体与唾液酸α2,6-半乳糖受体,只有少部分组织仅存在其中一种受体,这种受体分布的广泛性与流感病毒组织噬性相一致;但鼻甲与喉头中唾液酸受体明显低于许多其他组织,这也表明不能简单的通过唾液酸受体的有无或者密度高低来判定病毒在各组织中的实际分布与复制增殖情况,或许还有其他机制参与了病毒入侵与增殖的过程。; 刘兵黄冬陈普成柳金雄姜永萍陈化兰; 关键词：禽流感病毒免疫组化

编码H5N1亚型禽流感同义血凝素(HA)蛋白以及同义神经氨酸酶(NA)蛋白的基因及其应用: 本发明提供一种同时表达H5N1亚型禽流感同义血凝素蛋白和同义神经氨酸酶蛋白的重组表达载体，其中所述同义血凝素蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，所述同义神经氨酸酶蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，所述重组表...; 姜永萍陈化兰邓国华王靖飞陈普成柳金雄施建忠李雁冰; 文献传递

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柳金雄

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