石晴芳
- 作品数：3 被引量：8H指数：2
- 供职机构：湖北大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：河南省教育厅自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 嗜热古菌高温酸性淀粉酶基因合成和大肠杆菌中的表达被引量：4
- 2008年
- BD5088是来源于1种嗜热球菌Thermococcus sp.的高温酸性α-淀粉酶的人工突变体,研究中根据BD5088基因的氨基酸序列,经密码子优化,用2步PCR法合成去信号肽后的成熟肽基因。该基因全长1311bp,由436个氨基酸组成。现将其克隆到大肠杆菌的表达载体pET30a上,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达出的目的蛋白分子量约为48ku,大小与理论值一致,经过Ni+树脂纯化,得到纯化后的重组酶BD5088。重组α-淀粉酶BD5088具有α-淀粉酶的活性,最适反应温度范围为70～85°C,最适反应pH值为5.6～6.0,在100℃下酶活性半衰期约30min。活性不依赖于Ca2+。本研究为该基因在毕赤酵母中的表达和基因的定向进化改造打下了基础。
- 柯涛熊兰石晴芳马向东
- 关键词：基因合成酶学性质
- A154C/G155C双点突变对嗜热耐酸淀粉酶酶活性及热稳定性的影响被引量：3
- 2012年
- 利用重叠延伸法对嗜热球菌Thermococcus sp.的高温酸性α-淀粉酶基因BD5088进行体外A154C/G155C双点定点突变,通过原核表达载体pET30a构建表达载体pET-BD5088C2,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,酶学性质分析表明,突变淀粉酶拓宽了反应pH值范围,尤其是酸性条件下提高更为显著。BD5088淀粉酶在100℃条件下酶活力半衰期约为22min,而突变酶酶活力半衰期40min,突变酶酶活力比BD5088淀粉酶提高近1倍。加热60min时,突变酶酶活力仍可维持原活力的40%,而BD5088淀粉酶只能维持20%左右。说明其热稳定性得到有效的提高。另外,突变酶在中温和90℃条件下酶活力有所提高,65℃时酶活力提高将近1倍。结果表明,BD5088淀粉酶的154、155位残基的突变为Cys对维持其热稳定性起到重要的作用,并且对其酶学性质有较大的影响,可能参与了二硫键的形成。
- 柯涛刘征杨建伟牛秋红惠丰立石晴芳马向东
- 关键词：定点突变热稳定性二硫键
- 一种用于高效筛选极端酶突变基因的质粒营救法被引量：1
- 2009年
- 为简化定向进化筛选突变耐高温和耐酸碱酶等极端酶的繁复工作，建立了一种快速质粒营救法，可直接从加热处理的平板中回收携带有突变基因的质粒，用于进一步的随机突变基因的筛选和基因测序等。研究了在不同的热处理条件下的质粒营救效率，获得了质粒营救转化效率最高的处理条件。结果表明，本方法适于质粒大小在2-10kb范围的载体，可用于平板筛选最适酶活性温度在60-100℃、pH4-10的突变体酶，并可将一轮的筛选过程缩短1-2d。
- 柯涛胡凡石晴芳马向东
- 关键词：定向进化极端酶
