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survivin启动子调控肿瘤干细胞标记CD133基因siRNA增殖型溶瘤腺病毒的构建及对肝癌细胞生长的抑制作用: 2016年; 目的构建survivin启动子调控的靶向CD133基因的siRNA增殖型溶瘤腺病毒,研究其对肝癌细胞生长的影响。方法 RT-PCR法扩增survivin启动子,测序鉴定,双酶切连接,获得p H-XC2-survivin。酶切p H-XC2-survivin、p ZD55-CD133-siRNA获得survivin启动子表达框的亚克隆和CD133-siRNA基因表达框的亚克隆,连接获得survivin启动子调控的siRNA增殖型溶瘤腺病毒表达载体质粒p T-ZD55-CD133-siRNA。增殖型溶瘤腺病毒survivin-T-ZD55-CD133-siRNA经PCR和测序鉴定。qRT-PCR法检测CD133表达,Western blot法检测E1A,CCK-8法检测细胞生长,流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功构建增殖型溶瘤腺病毒survivin-T-ZD55-CD133-siRNA。qRT-PCR法检测CD133 mRNA明显下降,Western blot证实survivin-T-ZD55-CD133-siRNA在肿瘤细胞中表达E1A能抑制肝癌细胞CD133表达及生长。结论构建的增殖型溶瘤腺病毒可有效降低肝癌细胞CD133的表达,用于肝癌基因治疗的进一步研究。; 牛坚王月刘斌王人颢朱志军申海莲; 关键词：肝癌 CD133

下调CD133表达对肝癌干细胞上皮间质化和侵袭能力影响及机制探讨被引量：12: 2016年; 目的肿瘤干细胞是肿瘤复发和转移的原因。探讨CD133基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)的重组质粒,对人肝癌细胞株MHCC-H的CD133基因表达、上皮间质化和侵袭能力的影响。方法通过免疫磁珠分选MHCC-H细胞中的CD133阳性细胞,设计并合成特异性靶向CD133的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)片段,并构建pSuper retro GFP-neo-siRNA-CD133表达质粒,将其转入MHCC-H-CD133+细胞,并设空白对照组、阳性对照组。通过G418筛选出稳定株。通过粘附实验、Boyden小室实验和软琼脂克隆形成实验观察各细胞株侵袭能力的变化。采用明胶酶法测定肝癌细胞的基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和MMP-9的含量,蛋白质印迹法检测上皮间质化相关基因的变化。结果通过免疫磁珠分选后的MHCC-H细胞中CD133表达率为83.5%。qRT-PCR结果显示,shCD133组相对空白对照组的CD133表达量下降了80%,P<0.05。蛋白质印迹法检测结果显示,shCD133组的CD133表达明显下降,约为空白对照组的12%和shNC组的10%,均P<0.05。shCD133组的粘附能力为86.9±12.4,较空白对照组的568.5±53.2和shNC组的538.8±35.6明显下降,P<0.05。Boyden小室实验发现,shCD133组穿膜细胞数为(80.6±11.4)个,较空白对照组的(228.5±33.2)个和shNC组的(230.8±32.9)个明显减少,P<0.05。软琼脂克隆形成率的检测发现,shCD133的细胞克隆形成(60±5)个,比空白对照组的(178±23)个和shNC组的(168±25)个明显下降,P<0.05。明胶酶法检测发现,shCD133组MMP-2和MMP-9相对活性为0.4±0.14和0.6±0.16,较shNC组的1.03±0.19和1.3±0.16明显下降,P<0.05。蛋白质印迹法检测结果表明,shCD133组N-cadherin蛋白表达为36.3±4.5,Snail为53.6±6.7,Slug为41.63±5.6,Twist为39.4±3.9,均明显低于空白对照组的87.6±8.6、80.6±7.5、81.9±9.2和83.9±9.1,也明显低于shNC组的89.4±9.6、83.5±8.9、85.1±8.7和87.6±9.3,均P<0.05;而shCD133组E-cadherin表达为88.4±9.2,较空白对照组�; 牛坚王月; 关键词：肝癌干细胞 CD133 细胞浸润

重组慢病毒CD133-miR30-shRNA的构建及抗肝癌细胞生长的作用被引量：1: 2016年; 目的:构建沉默CD133基因的mi R30-CD133慢病毒,探讨其对肝癌细胞株SMMC7721生物学行为的影响。方法:针对已经筛选确定的CD133基因干扰有效序列,合成靶序列的Oligo DNA,与p PRIME载体连接。用p PRIME-mi R30-CD133、ps PAX2和p MD2G 3种质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,测定病毒滴度;荧光显微镜下测定病毒感染效率;q RT-PCR、Western blot检测CD133表达;CCK-8法检测细胞生长;annexin V/PI检测细胞凋亡。根据实验要求(1)Blank组;(2)sh NC组;(3)sh CD133组。结果:病毒滴度为6.58×109 PFU/m L,病毒感染效率为(80.8±9.1)%。q RT-PCR结果显示sh CD133组相对Blank组的CD133表达量的平均值为0.18±0.04,sh CD133组相对Blank组和sh NC组有显著的CD133敲减作用(P<0.05)。Western blot结果显示sh CD133组的CD133表达明显下降,约为sh NC组的10%(P<0.05)和Blank组的8%(P<0.05)。重组慢病毒抑制肝癌细胞生长,与Blank组(25.3%)、sh NC组(24.3%)相比,sh CD133组凋亡细胞比例(41.3%)显著增加(P<0.05)。结论:成功构建慢病毒PRIME-mi R30-CD133,为CD133基因的功能研究提供了工具。; 牛坚王月刘斌; 关键词：CD133 慢病毒

同种大鼠骨髓间充质干细胞诱导调节性B淋巴细胞的免疫负调节作用被引量：5: 2013年; 目的研究骨髓间充质干细胞（MSC）诱导调节性B淋巴细胞（Breg细胞）的免疫负调节作用。方法取DA大鼠MSC和Lewis大鼠B淋巴细胞共培养后，酶联免疫吸附试验（EUSA）检测MSC和B淋巴细胞混合培养组上清液中白细胞介素10（IL-10）的水平和分泌因子的变化；采用流式细胞技术分析B淋巴细胞增殖、凋亡、表型的变化和对抗原特异性T淋巴细胞增殖的影响，采用激光共聚焦显微镜观察Breg细胞对免疫复合物吞噬能力的变化。结果MS（2成功诱导产生高分泌IL-10的Breg细胞产生，表型为CDl9＋CDld＋CD5＋，MSC显著抑制B淋巴细胞的增殖，Breg细胞能抑制抗原特异性T淋巴细胞的增殖，并增加对免疫复合物的吞噬能力。结论MS（2诱导的Breg细胞具有明显的免疫负调节作用。; 王月牛坚; 关键词：间质干细胞 B淋巴细胞免疫耐受

Tim3对poly(I∶C)介导的小鼠Kupffer细胞分泌细胞因子的影响: 2016年; 目的探讨T细胞免疫球蛋白及黏蛋白家族-3(Tim3)对poly(I∶C)活化的小鼠肝Kupffer细胞调节作用并探讨其相关机制。方法将真核表达质粒pc DNA3.1-Tim 3转染小鼠肝Kupffer细胞,以Realtime PCR和Western blot法验证Tim 3在小鼠肝Kupffer细胞的表达。通过ELISA法检测质粒pc DNA3.1-Tim 3,并使用Tim 3阻断型抗体和核转录因子kappa B(NF-κB)抑制性配体对poly(I∶C)活化的小鼠肝Kupffer细胞因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)]产生影响,Western blot法检测NF-κB p65、IκBα蛋白表达。结果 Tim 3抑制小鼠肝Kupffer细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β,Western blot结果显示其降低小鼠肝Kupffer细胞NF-κB p65蛋白和提高IκBα蛋白表达。结论 Tim 3通过NF-κB通路参与了poly(I:C)诱导小鼠肝Kupffer细胞活化的调节。; 牛坚王月王人颢刘斌; 关键词：KUPFFER细胞小鼠

骨髓间充质干细胞诱导同种异体B细胞向CD5^+调节性B细胞转化体外实验被引量：1: 2013年; 目的研究骨髓间充质干细胞(BMSC)诱导高分泌IL-10的调节性B细胞(Breg)的产生及机制。方法采用成功分离的DA大鼠BMSC与Wistar大鼠B细胞共培养(BMSC+B)96h后,ELISA检测BMSC+B组细胞培养上清中IL-10的浓度和分泌细胞因子的变化,设单纯BMSC、单纯B细胞两组对照;流式细胞术分析B细胞表型的变化;通过加入中和抗体,观察细胞因子对BMSC诱导Breg细胞产生的影响。结果 BMSC+B组成功诱导产生高分泌IL-10的Breg细胞(P=0.006);Breg表型为CD19+CD1d+CD5+;IFN-β促进BMSC诱导Breg的产生(P=0.034)。结论 BMSC能诱导高分泌IL-10的CD5+Breg产生,该机制可能与BMSC自身分泌的IFN-β有关。; 王月汪海军刘斌王学浩牛坚; 关键词：骨髓间充质干细胞白细胞介素10 调节性B细胞

下调CD133表达对肝癌细胞恶性生物学行为的影响被引量：2: 2016年; 目的:探讨下调CDl33基因的表达对肝癌细胞生物学行为的影响。方法:将合成的CDl33小干扰核糖核酸分子(si RNA)转染至肝癌SMMC7721细胞并检测转染效率;分别以无转染与转染随机si RNA序列的SMMC7721细胞为空白对照和阴性对照,观察CDl33 si RNA转染后CDl33基因沉默效果,以及SMMC7721细胞主要生物学行为的变化。结果:转染24 h后,转染效率可达到(80.8±9.1)%;与空白对照组比较,CDl33 si RNA转染后的SMMC7721细胞CD133 m RNA及蛋白表达量分别降至空白对照组的10%与35%、细胞增殖活性明显降低、细胞凋亡率明显增加(41.3%vs.25.3%)并出现明显的S期阻滞,集落形成能力明显降低(均P<0.05)。阴性对照组与空白对照组各指标无统计学差异(均P>0.05)。结论:CDl33在肝癌细胞中可能起了癌基因作用,下调其表达能抑制肝癌的恶性生物学行为。; 牛坚朱乐乐王月刘斌; 关键词：肿瘤干细胞 CDL33

T细胞免疫球蛋白及黏蛋白家族-3对干扰素-γ活化的小鼠肝Kupffer细胞分泌炎性细胞因子的调节作用及机制被引量：2: 2015年; 目的探讨T细胞免疫球蛋白及黏蛋白家族-3(Tim3)对IFN-γ活化的小鼠Kupffer细胞的调节作用并探讨其相关机制。方法将真核表达质粒pc DNA3.1-Tim3转染小鼠肝Kupffer细胞,以Real-time PCR和Western blot检测Tim3在小鼠肝Kupffer细胞的表达。通过ELISA检测质粒pc DNA3.1-Tim3、Tim3阻断型抗体对IFN-γ活化的小鼠肝Kupffer细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)产生的影响,Western blot检测JAK2/STATl蛋白表达。结果 Real-time PCR检测结果显示,IFN-γ能够显著提高小鼠肝脏Kupffer细胞中Tim3 m RNA的表达水平(P<0.05);pc DNA3.1-Tim3组的TNF-α、IL-6和IL-1β分泌较对照组显著下降(P<0.01);ELISA结果显示,Tim3阻断型抗体组与对照组相比,TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌增加(P<0.01);Western blot检测显示,与对照组相比,Tim3阻断型抗体预处理的小鼠Kupffer细胞JAK2及STAT1蛋白的表达上调(P<0.05)。结论Tim3通过调控Jak2/Stat1蛋白表达参与了Kupffer细胞活化的调节。; 牛坚王月李克清朱志军刘斌; 关键词：KUPFFER细胞小鼠

CD90和IGF1R蛋白在原发性胆囊癌中的表达及意义被引量：2: 2016年; 目的：探讨CD90、IGF1R蛋白产物在原发性胆囊癌中的表达特点及关系。方法：应用免疫组化S-P法检测36例原发性胆囊癌中CD90、IGF1R的阳性表达率,并以同期20例慢性胆囊炎作对照（对照组）。结果：（1）原发性胆囊癌CD90蛋白阳性表达率63.89%、IGF1R蛋白阳性率47.22%,均显著高于对照组的0%、10%：（2）CD90蛋白在有淋巴结远处转移、NevinⅣ-Ⅴ期患者中阳性率（79.17%）高于无转移、NevinⅠ-Ⅲ期的患者（33.33%）：IGF1R在低分化、有淋巴结远处转移阳性率（84.62%、62.50%）高于高中分化、无转移（26.09%、16.67%）：（3）IGF1R与CD90两者呈正相关（P〈0.05）：（4）CD90阳性（IGF1R阳性）患者生存率明显低于CD90阴性（IGF1R阴性）患者。结论：联合检测CD90、IGF1R蛋白在原发性胆囊癌中表达有助于反映原发性胆囊癌生物学特性、为预后判断提供参考指标。; 牛坚王月刘斌朱志军申海莲; 关键词：原发性胆囊癌肿瘤干细胞

小分子干扰RNA沉默T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3表达对暴发性肝衰竭小鼠Kupffer细胞分泌细胞因子的影响被引量：2: 2015年; 目的探讨T细胞免疫球蛋白及黏蛋白家族3(Tim-3)的小分子干扰RNA(si RNA)质粒对暴发性肝衰竭小鼠肝Kupffer细胞活化的调节作用并探讨其相关机制。方法采用D-氨基半乳糖(D-Galactosamine,D-Gal N)和脂多糖(LPS)建立暴发性肝衰竭小鼠模型。将30只大鼠分成对照组及模型组,每组15只。分离所有小鼠Kupffer细胞,用特异性靶向Tim-3的si RNA片段沉默小鼠肝Kupffer细胞中的Tim-3,同时将模型组小鼠进一步分成空转染组、特异si RNA组及阴性si RNA组。采用Real time PCR和Western blot检测Tim-3的表达,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Tim-3沉默后Kupffer细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)及IL-6的表达,并采用ELISA及Western blot检测核因子-κB(NF-κB)通路对炎性细胞因子表达的影响。结果模型组Tim-3 m RNA的表达显著高于对照组(48.3±6.8 vs.10.3±1.8,t=0.007,P<0.05),且特异si RNA组Tim-3 m RNA的表达(18.3±3.5)显著低于空转染组(58.3±7.5)及阴性si RNA组(57.3±7.1)的表达(F=118.5,P<0.05)。在转染后3、6、24 h,特异si RNA组中TNF-α(F=68.76、73.55、92.36,P均<0.05),IL-1β(F=32.1、86.5、112.3,P均<0.05)及IL-6(F=178.9、98.7、89.9,P均<0.05)的表达均显著高于空转染组及阴性si RNA组。同时,特异si RNA组的NF-κB蛋白的表达在转染3 h(F=48.9,P=0.020)、6 h(F=107.4,P=0.002)、24 h(F=148.9,P=0.001)均显着高于空转染组及阴性si RNA组。结论 Tim-3通过NF-κB蛋白表达参与了暴发性肝衰竭小鼠肝Kupffer细胞活化的调节。; 牛坚王月刘斌朱志军申海莲; 关键词：枯否细胞小鼠

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王月

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