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抗人B7-H1单克隆抗体的制备和鉴定被引量：1: 2010年; 目的:采用杂交瘤技术制备抗人B7-H1单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法:经抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞以常规方法融合;用间接ELISA法筛选分泌抗体的杂交瘤细胞株;阳性克隆用有限稀释法获得稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;扩增杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔后制备腹水;纯化腹水中的单克隆抗体并对其亚型进行鉴定;用间接ELISA法测抗体效价;将肺癌组织制成石蜡切片,用抗人B7-H1抗体进行免疫组化染色。结果:获得1株稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型为IgG1;抗体效价为1×108,纯化后的抗体含量为6.76g/L;免疫组化实验中,单抗可与肺癌组织表面的B7-H1蛋白特异地结合。结论:制备了人B7-H1单克隆抗体,为B7-H1检测试剂盒的研制奠定了基础。; 舒震侯登勇李晶侯健伟徐玉金陈琳张伟张英起; 关键词：杂交瘤细胞单克隆抗体

含蛋白转导域的SARA/SBD融合蛋白的原核表达、纯化及生物学活性鉴定被引量：1: 2011年; 目的:SARA/SBD是纤维化形成过程中的负性调节因子。原核表达、纯化含反式激活蛋白(TAT)蛋白转导域(PTD)的TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法:将TAT PTD-SARA/SBD基因克隆入带His标签的原核表达载体pET-44a(+)中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE和Western印迹鉴定目的蛋白;用人腹膜间皮细胞系(HPMC),通过免疫细胞化学方法检测其穿膜能力,及与TGF-β1信号通路中Smad2因子的共定位情况。结果:用基因工程方法表达和纯化了TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,目的蛋白约占菌体总蛋白的20%左右,且以可溶形式表达,经Ni2+-NTA纯化后,所获蛋白纯度高于95%(HPLC归一法);功能学实验结果显示该蛋白能穿过胞膜,主要定位于胞核,且与Smad2因子具有核内共定位。结论:表达了TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,该蛋白具有生物学活性。; 李曼黄晨张伟王增禄李晶杜锐孙世仁张鹏张英起; 关键词：蛋白转导域原核表达纯化生物学活性

重组人半乳凝集素-1的原核表达、纯化及生物活性检测: 2010年; 目的:在大肠杆菌中表达半乳凝集素-1(galectin-1),并进行纯化及生物活性检测。方法:将人半乳凝集素-1基因克隆至带有His融合标签的原核表达载体pQE-30上,转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,表达产物经亲和层析纯化后,进行Western印迹鉴定,并用红细胞凝集试验检测其生物学活性。结果:双酶切鉴定和核苷酸序列测定表明重组表达质粒pQE-30-Galectin-1构建正确;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的50%,主要以可溶形式表达,纯化后蛋白纯度达95%以上,且具有良好的红细胞凝集活性。结论:在大肠杆菌中表达了重组人半乳凝集素-1,且具有良好的生物活性。; 李晶贺丽清舒震侯建伟陈霖徐玉金张伟张英起; 关键词：原核表达纯化

PD-1核心启动子的获得及活性鉴定: 2010年; 目的:构建PD-1(programmed death receptor 1)全长启动子及不同截短体的报告基因,并对其转录活性进行检测。方法:通过PCR及双酶切方法,从人全血基因组DNA中获得PD-1基因编码序列,包含不同长度碱基的PD-1启动子序列,分别克隆到报告基因pGL3-Basic载体上,构建8个不同长度PD-1启动子的报告基因;用脂质体转染法将8个报告基因分别转染至Jurkat细胞系;采用双萤光素酶报告基因系统评估PD-1启动子的活性。结果:经PCR方法扩增出大小分别为1650、1450、1250、1128、874、674、474和274 bp的不同长度的PD-1启动子序列,测序正确(与GenBank报道一致),酶切鉴定正确;瞬时转染Jurkat细胞系后经报告基因检测,8个启动子均具有转录活性。结论:构建了PD-1启动子的报告基因,并证实均有转录活性,且以pGL3-1128活性最高,为PD-1的核心启动子,为进一步研究PD-1的转录调控奠定了实验基础。; 侯建伟秦鑫李晶舒震陈霖徐玉金赵薇张伟张英起; 关键词：PD-1 核心启动子转录调控

重组蛋白转导结构域-SARA融合蛋白生物学功能的初步研究被引量：1: 2010年; 目的初步研究重组蛋白转导结构域(Protein transduction domain,PTD)-SARA融合蛋白(PTD-SARA)抗肾脏纤维化的生物学功能。方法采用免疫细胞化学法检测重组PTD-SARA融合蛋白的穿膜作用;通过显微镜观察人肾小管上皮细胞HK2形态学变化,Western blot法测定上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和磷酸化Smad3蛋白水平,以比较PTD-SARA融合蛋白和SARA蛋白抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱发的肾小管上皮细胞向间质细胞转分化作用。结果重组PTD-SARA融合蛋白可高效地转入细胞胞质与胞核;PTD-SARA融合蛋白与SARA蛋白相比,能更显著地上调E-cadherin蛋白的表达,下调α-SMA和磷酸化Smad3蛋白的表达,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论与SARA蛋白相比,PTD-SARA融合蛋白可以高效地进入细胞胞质及胞核,并能明显地抑制TGF-β1诱发的肾小管上皮细胞向间质细胞转分化作用,为进一步研究重组PTD-SARA融合蛋白防治肾脏纤维化奠定了基础。; 加慧卫黄晨李晶张英起孙世仁杜锐; 关键词：SARA 蛋白转导结构域融合蛋白质类纤维化

重组人B7-H1IgV发酵纯化工艺的建立及其抑瘤活性被引量：1: 2010年; 目的建立大规模生产重组人B7-H1IgV(rhB7-H1IgV)的发酵和纯化工艺,并检测纯化蛋白的抑瘤活性。方法对rhB7-H1IgV工程菌进行发酵培养,IPTG诱导表达,采用超声裂菌分离包涵体,梯度复性,2次Ni亲和层析等步骤纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE、Westernblot分析及抑瘤活性检测。结果在建立的发酵工艺下,rhB7-H1IgV的表达量可达菌体总蛋白的(10～11)%;纯化的rhB7-H1IgV蛋白经HPLC检测,纯度可达95%以上,Westernblot检测具有良好的反应原性;动物实验表明纯化的重组蛋白能诱导BALB/c小鼠产生高滴度的抗B7-H1抗体,且对肿瘤的生长具有明显的抑制作用。结论所建立的rhB7-H1IgV发酵纯化工艺简单迅速,为其开发和应用奠定了基础。; 陈霖李晶侯建伟舒震张伟张英起; 关键词：B7-H1 发酵纯化抑瘤活性

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李晶