刘玮
- 作品数：10 被引量：16H指数：3
- 供职机构：青岛农业大学更多>>
- 发文基金：山东省科技攻关计划重大科技专项国家高技术研究发展计划山东省自主创新成果转化重大专项项目更多>>
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- 不同培养条件对牛核移植胚胎体外发育的影响被引量：3
- 2008年
- [目的]进一步优化牛核移植胚胎的体外培养体系。[方法]在培养液中添加谷胱甘肽和胚胎培养的0～3d采用5％O2浓度，在不同培养条件下对牛核移植重构胚胎进行体外培养，测定卵裂率、8细胞发育率、桑椹胚率以及囊胚发育率。[结果]结果表明，试验组B的8细胞发育率（38.3％）、桑椹胚率（17．0％）和囊胚率（8.5％）与对照组A（17．9％、1．3％、1．3％）差异显著（P〈0．05）。试验组B和试验组c的桑椹胚率（17.0％、11.8％）、囊胚率（8．5％、7．8％）与对照组A（1．3％、1．3％）均差异显著（P〈0．05）。[结论]在培养液中添加谷胱甘肽和胚胎培养的0～3d采用低O2浓度（5％O2），能够提高牛核移植胚胎的体外发育率。
- 史文升村上正夫柏学进王文明刘玮董雅娟
- 关键词：核移植胚胎体外发育
- 牛朊蛋白基因真核表达载体的构建及其在牛骨髓间充质干细胞中的稳定表达
- 2012年
- 试验构建牛朊蛋白(prion protein,PRNP)基因的真核表达载体,为进一步研究牛朊蛋白的生理功能和从细胞水平研究抗疯牛病转基因克隆牛奠定基础。采用重叠延伸PCR(splicing overlap extension PCR,SOE-PCR)法扩增获得牛PRNP基因序列,并克隆到带有DsRED2报告基因的真核表达载体pDsRED2-N1中,将双酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒经脂质体转染牛骨髓间充质干细胞(BMSC);通过荧光显微镜观察转染细胞,并用800μg/mL G418对转染的细胞进行药物筛选。琼脂糖凝胶电泳显示基因合成的片段大小和构建的载体大小与预期相符;重组表达载体转染BMSC后有红色荧光出现;通过药物筛选出了稳定转染的细胞单克隆。通过SOE-PCR成功扩增了牛PRNP基因序列,并构建成真核表达载体,得到稳定表达目的蛋白的BMSC细胞。
- 宋少康董雅娟柏学进王文明刘玮牛召珊赵仕全杨莉
- 关键词：疯牛病SOE-PCRBMSC
- 不同培养液对牛卵母细胞成熟及核移植效率的影响被引量：1
- 2010年
- 在牛卵母细胞成熟液中分别添加促卵泡素(FSH)10μg/L、胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)10μL/mL、表皮生长因子(EGF)10μg/L,配成3种不同体外成熟液对牛卵母细胞进行成熟培养,结果FSH组卵母细胞成熟率84.2%显著高于ITS组75.9%和EGF组70.2%。卵母细胞成熟后构建牛体细胞核移植胚胎,结果FSH、ITS组卵裂率分别为87.2%、81.9%,显著高于EGF组(73.6%),但三组间囊胚率差异不显著(P>0.05)。
- 王文明董雅娟柏学进村上正夫刘玮张守宝
- 关键词：卵母细胞成熟促卵泡素ITS表皮生长因子
- 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养及分子生物学鉴定被引量：4
- 2010年
- 利用贴壁筛选法分离培养奶牛乳腺上皮细胞,并对其进行核型分析和RT-PCR鉴定。结果表明,体外培养的奶牛乳腺上皮细胞生长旺盛,具有典型的上皮细胞形态特征,体外传代15次后核型未发生改变。RT-PCR鉴定结果表明,分离培养的细胞明显表达奶牛乳腺上皮细胞的2种特异性基因,即as1酪蛋白基因(1 736 bp)和k酪蛋白基因(780 bp)。
- 刘玮董雅娟柏学进王文明张守宝董懿为
- 关键词：乳腺上皮细胞
- 奶牛乳腺上皮细胞电穿孔法转染乳铁素H基因的研究
- 本试验通过建立奶牛乳腺上皮细胞(bovinemammaryepithelialcells，BMEC)分离培养体系，研究奶牛乳腺上皮细胞的生物学特性;构建乳铁素H真核表达载体，提高转基因的效率;利用电穿孑乙转基因方法将乳铁...
- 刘玮
- 关键词：乳腺上皮细胞电穿孔奶牛
- 不同饲养层对牛胚胎干细胞培养的影响被引量：2
- 2010年
- 本研究建立牛胚胎干细胞(Bovine Embryonic Stem Cells ESCs)的分离培养体系,摸索牛ESCs的培养条件。对牛运用FSH减量注射法进行超数排卵获取胚胎。从获得的胚胎中分离ESCs,在不同的饲养层(牛骨髓间充质干细胞、牛成纤维细胞、牛乳腺干细胞)上培养,对牛ESCs进行形态学观察及鉴定。牛MSCs做饲养层与牛SFCs、牛MaSCs相比差异显著,牛MSCs的效果最佳(P<0.05)。牛ESCs在牛MSCs做饲养层的条件下更易生长。分析了不同饲养层对牛ESCs分离培养的影响,建立了一种分离培养牛ESCs的饲养层体系,为进一步深入研究ESCs的诱导分化和应用打下基础。
- 张守宝柏学进朱金香王文明刘玮董雅娟
- 关键词：超数排卵饲养层
- 体外诱导牛骨髓间充质干细胞向乳腺样上皮细胞分化的初步研究被引量：5
- 2012年
- 为培育转基因肉牛提供种子细胞及进一步丰富牛骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)的多向分化潜能,本试验利用细胞免疫荧光染色方法和分子生物学方法初步探讨在表皮生长因子、胰岛素、催产素和孕酮等条件下,体外诱导牛BMSC向乳腺样上皮细胞分化的可能性。利用不同浓度的诱导液对纯化稳定的P4、P8和P12代牛BM-SC进行体外诱导,并对诱导后的细胞进行细胞免疫荧光观察和RT-PCR鉴定。结果显示,诱导后部分BMSC细胞呈多角形,而不再呈明显的梭形和纺锤形,经细胞角蛋白18免疫荧光染色后出现明显的荧光。P4代牛BMSC在诱导液Ⅱ的诱导作用下分化效果显著。RT-PCR结果显示,诱导分化后细胞角蛋白19基因、β-酪蛋白基因及αs1-酪蛋白基因在细胞中表达。因此,在体外,多因子联合诱导可使牛BMSC初步分化为乳腺样上皮细胞并且在诱导液Ⅱ的联合诱导下分化作用最明显。
- 朱孟芝董雅娟龚宜超王文明刘玮柏学进
- 关键词：骨髓间充质干细胞表皮生长因子催乳素孕酮
- 细胞电穿孔转基因方法表达抗菌肽的研究进展
- 电穿孔法是在一定参数的电场作用下使细胞膜上暂时出现微小孔洞，在微孔开启期间外界环境中的各种生物分子穿孔而入，进入细胞核内的方法。抗菌肽是天然免疫的主要成分，它不会诱导抗菌株的产生，对原核生物细胞有很高的杀菌活性，而对真核...
- 刘玮董雅娟柏学进封纪武肖超柱
- 关键词：抗菌肽电穿孔法真核细胞转基因动物动物繁殖
- 文献传递
- 利用RNAi抑制牛骨髓间充质干细胞中朊蛋白基因(PRNP)的表达被引量：1
- 2012年
- 利用RNAi技术,根据牛源PRNP基因cDNA设计3段siRNA序列和1个阴性对照序列,分别将其连接到RNA干扰载体pRNAT-U6.1/Neo上构建成shRNA载体,并将shRNA载体转染牛骨髓间充质干细胞(BMSC);通过Real-time PCR和Western Blotting筛选抑制效果最佳的载体;并用800mg/L G418对转染最佳载体的细胞进行药物筛选。结果显示:成功构建了3个靶向shRNA载体和1个阴性对照shRNA载体;转染后48h在荧光镜下检测各组均可观察到绿色荧光的表达;Real-time PCR和Western Blotting结果显示,3个靶向shRNA载体在不同时间段均在一定程度上下调了PRNP mRNA的表达,抑制了朊蛋白PrPC的生成,得到了1个最佳干扰载体sh3;通过药物筛选出了稳定转染的细胞单克隆。本研究获得了1个有效抑制朊蛋白基因表达的shRNA载体,并筛选出稳定转染的细胞单克隆,上述结果可为抗疯牛病体细胞核移植提供供体细胞。
- 宋少康董雅娟柏学进王文明刘玮牛召姗赵仕全杨莉
- 关键词：PRNPBMSC
- 体外诱导牛BMSC向上皮样细胞分化的研究
- 2012年
- 为培育转基因肉牛提供种子细胞以及进一步丰富牛骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)的多向分化潜能,利用细胞免疫荧光染色和分子生物学方法,初步探讨表皮生长因子和胰岛素体外诱导牛BMSC向上皮样细胞分化的可能性。利用含细胞因子的诱导液对纯化稳定的P4代牛BMSC进行体外诱导,并对诱导后的细胞进行细胞角蛋白18的细胞免疫荧光观察和细胞角蛋白19的RT-PCR鉴定。结果表明,诱导后细胞经细胞角蛋白18免疫荧光染色后出现明显的荧光。RT-PCR结果显示诱导分化后细胞角蛋白19基因在细胞中表达。因此,在体外,表皮生长因子和胰岛素可诱导牛BMSC初步分化为上皮样细胞。
- 朱孟芝董雅娟龚宜超王文明刘玮柏学进
- 关键词：表皮生长因子胰岛素上皮样细胞
