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伍志坚: 作品数：16 被引量：198H指数：7; 供职机构：中国预防医学科学院更多>>; 发文基金：国家高技术研究发展计划国家攀登计划国家自然科学基金更多>>; 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>

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一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法被引量：109: 2000年; 利用2型腺病毒伴随病毒(adeno-associated virus type 2, AAV-2)能够抵抗氯仿的特性, 采用"氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提" 3个步骤分离、浓缩和纯化重组腺病毒伴随病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV), 整个纯化过程可在4 h内完成. 最终从5个转瓶生长的4×109个载体生产细胞中可得到5×1013 病毒颗粒/mL, SDS-聚丙烯酰胺凝胶结果表明, rAAV的纯度大于95%, 电子显微镜下绝大多数病毒颗粒的结构完整. 纯化后的rAAV仍保持较强的感染性, 其感染性滴度达到2×1012 转导单位(transducing unit, TU)/mL, 总的病毒颗粒数与感染性病毒颗粒数的比值为25. 为rAAV 大规模生产后的纯化提供了一种简便、快速、低成本的方法.; 吴小兵董小岩伍志坚屈建国侯云德; 关键词：氯仿纯化病毒学

HSV/AAV嵌合病毒法制备rAAV/hFⅨ及其安全性检测被引量：5: 2003年; 构建了由CMV启动子调控的人凝血因子Ⅸ小基因的重组腺相关病毒载体, 并通过HSV/AAV杂合辅助病毒的方法大量制备成重组腺相关病毒颗粒(rAAV/hFⅨ). 经Southern dot blot及QC-PCR法测定, 滴度达到3.6 × 1012 vg(病毒基因组)/mL. 将rAAV/hFⅨ病毒以7.5 × 1011 vg/只直接注射到血友病B小鼠股四头肌中, 检测到人Ⅸ因子最高表达量达到387 ng/mL血浆, 持续表达时间12周. 血浆中产生的抗体情况与表达曲线相吻合. 实验结果表明, 采用HSV/AAV杂合辅助病毒法能够有效解决AAV载体的大量制备问题, QC-PCR法检测重组腺相关病毒的滴度比传统的点杂交法更加快速准确. RT-PCR检测表明重组AAV中没有野生型HSV的污染, PCR检测表明重组AAV注射后, 重组AAV病毒仅存在于注射点附近的肌肉中, 未见扩散.; 陈立邹蓓艳陈浩明伍志坚吴小兵卢大儒薛京伦; 关键词：重组腺相关病毒载体凝血因子血友病B

含HIV-1 gag、gag V3基因的重组腺病毒伴随病毒的构建及其免疫原性的研究被引量：2: 2001年; 将HIV - 1中国株 42 (B亚型 )的 gag 基因及 gag与 gp12 0V3区的嵌合基因 gagV3插入腺病毒伴随病毒(AAV)表达载体pSNAV质粒中 ,构建重组质粒 pSNAV gag及pSNAV gagV3;采用脂质体转染的方法分别将重组质粒转入BHK细胞 ,G418筛选得到转入重组质粒并能表达外源基因的细胞系 ,命名为BHK gag及BHK gagV3。用具有重组腺病毒伴随病毒 (rAAV)包装功能的一种重组单纯疱疹病毒 (rHSV)分别感染这两株细胞系 ,纯化后得到rAAV ,电镜观察可见到大量实心病毒颗粒 ,核酸杂交检测重组病毒滴度达到 10 12 病毒颗粒 /ml,重组病毒感染2 93细胞 ,ELISA检测有 gag 及 gagV3基因的表达。用重组病毒免疫Balb/C小鼠 ,检测抗体及细胞免疫水平 ,证明重组病毒可以在小鼠体内诱导产生细胞及体液免疫。; 刘雁征吴小兵周玲伍志坚侯云德曾毅; 关键词：人免疫缺陷病毒1型 HIV-1 细胞毒性T淋巴细胞 CTL活性

表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒伴随病毒的产生被引量：12: 2001年; 伍志坚吴小兵曹晖牛东滨王宏侯云德; 关键词：绿色荧光蛋白基因治疗

肌注腺伴随病毒基因治疗血友病B的安全性研究被引量：4: 2001年; 研究了肌注腺伴随病毒 (adeno -associatedvirus,AAV)介导凝血Ⅸ因子基因治疗血友病B的安全性。首先采用PCR、反转录PCR(RT -PCR)分别检测rHSV/AAV包装系统产生的重组腺伴随病毒AAV -mFⅨ ,和病毒感染细胞后所得上清再次感染的BHK细胞中的HSV(herpessimplexvirus,HSV)和野生型AAV。同时观察HSV引起的细胞毒作用。结果表明 :纯化后的AA -mFⅨ中HSV≤ 1个病毒基因组 (viralgenome ,v g ) /10 8个病毒基因组AAV -mFⅨ ,且不具备感染活性 ;没有野生型AAV。其次 ,采用PCR、RT -PCR、免疫组化等方法检测了AAV -mFⅨ在体内的分布和表达时间 ;通过抗AAV的抗体检测和病理切片等方法观察了AAV -mFⅨ在体内引起的免疫反应和病理变化。结果表明 :AAV -mFⅨ仅分布在注射点肌肉组织内 ,表达可持续 2 0 0天以上 ;抗体水平低 ,各主要脏器均未发生明显的病理变化。AAV介导的凝血因子Ⅸ系统是安全的。; 邹蓓艳陈立伍志坚吴小兵卢大儒邱信芳薛京伦; 关键词：HSV 基因治疗肌注血友病

一种高效的重组腺伴随病毒载体生产系统被引量：45: 2001年; 重组腺伴随病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)载体是目前较理想的基因治疗载体之一, 但难以大规模制备一直是影响其广泛应用的主要因素. 曾组建了一种表达2型腺伴随病毒 (adeno-associated virus type 2, AAV-2) Rep和Cap的重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/DUL2, 现在此基础上, 证实了该重组病毒支持rAAV的复制与包装, 包装出的rAAV具有感染性; 构建了携带新霉素抗性基因、适合多种外源基因插入的通用型rAAV载体质粒pSNAV-2 及表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的rAAV载体质粒pSNAV-2-GFP, 建立了稳定携带GFP基因表达盒的rAAV载体细胞株; 确定了HSV1-rc/DUL2感染载体细胞株时的最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI)为0.1; 采用"一种病毒感染一个载体细胞株"的策略, 用"感染"的方式代替传统的"转染"方式, 使每个细胞产生的rAAV比传统方式提高了2个数量级以上, 并实现了rAAV的规模化制备, 为rAAV用于基因治疗的临床试验打下了基础.; 伍志坚吴小兵曹晖董小岩王宏侯云德; 关键词：重组腺伴随病毒基因治疗绿色荧光蛋白

携带反义凝血酶受体和p21双基因共表达腺病毒伴随病毒载体的构建与包装: 2002年; 为探讨双基因共表达对再狭窄的防治作用 ,分别构建了含反义凝血酶受体 (ATR)或 /和 p2 1单、双基因及报告基因绿色荧光蛋白 (GFP)的腺病毒伴随病毒 (AAV)载体 .上述载体经脂质体介导转染BHK 2 1细胞 ,G4 18筛选获得整合有外源基因的细胞株 .克隆形成过程中显示单、双基因转染后细胞增殖受到了不同程度的抑制 ,克隆形成速度减慢 ,细胞形态改变 ,且双基因的作用明显大于单基因 .以绿色荧光出现说明报告基因得到表达后 ,又以DNA印迹证实ATR和p2 1单、双基因已整合于细胞基因组中 ,并维持了凝血酶受体 (TR)基因的反义位置 .半定量RT PCR证实TR基因表达降低 ,p2 1基因表达升高 ,ATR和p2 1(AP)双基因得到了共表达 .以具有可提供复制和包装功能的重组单纯疱疹病毒rHSV rc/ΔU12分别感染载有不同基因的BHK细胞株 ,包装产生重组AAV (rAAV)病毒 ,并经点杂交法测定其滴度 (每毫升病毒液中所含病毒颗粒数 ) .rAAV/AP中ATR与 p2 1的病毒颗粒数分别为 1 0 2× 10 13 /ml和 1 0 8× 10 13 /ml,单基因rAAV/ATR的滴度为 6 5 4× 10 12 /ml,rAAV/P2 1为 1 0 6× 10 13 /ml,为进一步的体内外实验奠定了物质基础 .; 孟宪敏吴小兵米立国伍志坚赵秀文刘冬青丁金凤; 关键词：共表达再狭窄

一种可切除包装信号的重组1型单纯疱疹病毒的产生: 2000年; A new kind of recombinant herpes simplex virus type 1 (HSV 1) was constructed. This recombinant, named HSV1 LaL, contained an unique packaging signal (“a" sequence) flanked by two loxP sites in parallel orientation, named LaL, while the original packaging signals of HSV 1 were deleted. Based on a set of cosmids containing the entire HSV 1 genome except the “a" sequence, the LaL was inserted into HSV 1 UL44 gene on one of the cosmids, cos56, generating cos56/LaL. By co transfecting cos56/LaL with the other cosmids, HSV1 LaL was generated in the cells by recombination. By introducing cos56/LaL or HSV1 LaL respectively into E.coli or BHK cells that expressed Cre recombinase, LaLs on both of them were excised by Cre, which was proved by PCR detection. To study the potential use as helper virus in packaging amplicon vector, HSV1 LaL was compared with a control virus HSV1 lacZ that contained a lacZ gene in the UL44 gene. The titer of amplicon virus generated from HSV1 LaL infected BHK/Cre cells was basically the same as that from HSV1 lacZ infected cells, however,the former contained about 10 fold less helper virus than the later, while HSV1 LaL showed the same replication rate as HSV1 lacZ on standard cells, like BHK 21.; 曹晖吴小兵伍志坚侯云德; 关键词：CRE/LOXP系统

重组腺相关病毒(rAAV)介导的人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物在血友病B基因治疗研究中的应用被引量：7: 2001年; 采用定点诱变技术,将R338A点突变引入人凝血因子Ⅸ基因,并构建于AAV载体上,以rHSV/AAV杂合辅助病毒系统介导制备rAAV-hFIX重组病毒,然后,经肌肉注射对血友病B小鼠进行治疗实验,观察该突变基因在小鼠体内的表达、活性以及机体对该突变衍生物的免疫反应与治疗效果.结果显示:（i）治疗小鼠体内可检测到hFIX-R338A突变衍生物的存在,并持续15周以上;（ii）突变衍生物hFIX-R338A在小鼠血浆中的凝血活性达（34.2±5.23）％,显著高于野生型Ⅸ因子凝血活性（（14.27±3.4）％）;（iii）治疗小鼠体内未检测到抗Ⅸ因子突变衍生物抗体的存在;（iv）未发现与治疗相关的局部及全身性毒副作用.提示:以AAV介导人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物hFIX-R338A基因治疗可能成为替代野生型Ⅸ因子进行血友病B基因治疗的一个更为有效的途径.; 陆华中陈立王红卫卢大儒邱信芳薛京伦伍志坚吴小兵王学峰王鸿利; 关键词：血友病B 凝血因子IX 重组腺相关病毒

系列腺病毒伴随病毒载体的构建及表达β-半乳糖苷酶的研究被引量：33: 2000年; 为了便于开展用重组腺病毒伴随病毒 (recombinantadeno associatedvirus,rAAV)载体进行基因治疗的研究 ,构建了三种通用型AAV载体 pWAV 1、pWAV 2和 pSNAV ,每种载体均含有AAV 2两端的倒转末端重复序列 (in vertedterminalrepeats,ITR) ,中间依次为巨细胞病毒 (CMV)立早增强子和启动子、多克隆位点和 polyA信号。研究者只需将目的基因正向插入多克隆位点 ,即可获得具有完整表达盒的AAV载体质粒。pWAV 1的多克隆位点包括NheⅠ、XhoⅠ、PstⅠ和BamHⅠ ,可插入外源基因的最大容量为 3 3kb ;pWAV 2的多克隆位点为 Kpn Ⅰ、EcoRⅠ、SalⅠ ;pSNAV的多克隆位点为Kpn Ⅰ、EcoRⅠ、SalⅠ和 BglⅡ ,二者所能装载的外源基因容量均为3 6kb。同时 ,还构建了携带 β 半乳糖苷酶基因的AAV载体 pAV lacZ、pSNAV lacZ ,并对制备rAAV的常规方法———共转染法进行了改进。用先前报道的具有rAAV包装功能的一种重组单纯疱疹病毒 (recombinantherpessim plexvirus,rHSV)分别感染经pAV lacZ、pSNAV lacZ转染的BHK 2 1细胞 ,可获得携带 β 半乳糖苷酶基因的rAAV ,滴度达到 5× 10 4 转导单位 (TU) /ml,为实现“一种病毒感染一个载体细胞株”; 伍志坚吴小兵侯云德

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