高兴
- 作品数：6 被引量：16H指数：3
- 供职机构：第三军医大学西南医院更多>>
- 发文基金：重庆市自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- Puma荧光素酶报告基因的构建和鉴定
- 2011年
- 目的为研究p53家族调控细胞凋亡的机制，构建并鉴定插入人Puma基因的启动子片段的荧光素酶报告基因载体。方法采用PCR技术从人类HepG2细胞中扩增Puma启动子的含p53反应元件的180bpDNA片段，插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。经测序确定所扩增的DNA序列；将其转染人人类肺腺癌141299细胞中，双报告基因实验检测荧光素酶活力。结果测序结果表明扩增的Puma启动子序列正确，活性检测显示构建的报告基因具有启动子活性。结论克隆了含p53反应元件的Puma启动子，成功构建了人类Puma启动子报告基因，为p53家族凋亡通路的功能研究提供了必要的实验材料。
- 杨新邱实顾寿智蔡云高兴刘泽军
- 关键词：PUMA启动子荧光素酶报告基因凋亡
- 定点诱变法构建p53基因多态质粒
- 2010年
- 目的:为了研究p53codon72多态的功能,采用定点诱变法构建人p53基因的多态质粒。方法:设计带有突变碱基的引物,通过PCR扩增引入突变碱基,再将突变后的p53序列插入载体中,经测序确定所扩增的DNA序列,并用体外转录翻译系统制备p53蛋白和i ASPP蛋白,免疫沉淀法检测蛋白相互作用。结果:通过PCR获得的含突变碱基的p53序列经连接后插入真核表达载体pReceiver-M01中,构建了p53多态位点为72Arg的表达质粒pReceiver-M01-p53(Arg72)。测序证明序列正确,表达的p53蛋白能与i ASPP相互作用,具有生物学功能。结论:成功构建了p53多态(72Arg)真核表达载体,为进一步深入研究p53多态的生物学功能奠定了基础。
- 邱实蔡云高兴顾寿智刘泽军
- 关键词：定点诱变重叠延伸PCR
- 干扰iASPP基因对转染MCF-7细胞凋亡变化的观察被引量：3
- 2008年
- 目的:观察iASPP基因干扰RNA转染乳腺癌细胞MCF-7后的干扰效果及细胞凋亡变化。方法:设计特异性siRNA序列,将序列克隆至PGCsilencerTM H1/Neo/GFP质粒中,用脂质体将重组子转染至MCF-7细胞中,用RT-PCR方法检测i ASPP的表达,蛋白质印迹法检测蛋白表达的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。结果:iASPP干扰质粒转染MCF-7细胞后,iASPP的mRNA表达和蛋白表达减少40%～50%;p53蛋白相对表达量由转染阴性质粒的0.37增加到转染干扰质粒的0.64;细胞凋亡率由原来的17.8%和16.2%分别增加到53.5%和51.3%。结论:抑制内源性i ASPP能有效地恢复乳腺癌细胞MCF-7中p53的抑癌功能,为乳腺癌的治疗提供新的思路。
- 侯露蔡云陈杰辛海明高兴卢欣钟山刘泽军
- 关键词：乳腺肿瘤肿瘤抑制RNA干扰细胞凋亡
- 人Bax启动子荧光素酶报告基因的构建和鉴定被引量：8
- 2009年
- [目的]克隆人Bax基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并在细胞内检测其活性。[方法]采用PCR技术从人HepG2细胞中扩增出Bax启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,经测序确定所扩增的DNA序列,并将其转染入H1299细胞中检测其活性。[结果]测序结果表明扩增的Bax启动子序列正确,双报告基因实验检测荧光素酶活力表明构建的报告基因具有启动子活性。[结论]克隆了Bax启动子,成功构建了人Bax启动子报告基因,为p53家族凋亡通路的功能研究提供了必要的实验材料。
- 高兴蔡云辛海明张晓兵扬新刘泽军
- 关键词：BAX启动子荧光素酶报告基因
- iASPP在p53缺失肿瘤细胞中影响细胞凋亡的机制被引量：1
- 2011年
- 目的阐明iASPP在p53缺失细胞中影响细胞凋亡的机制。方法将iASPP、干扰iASPP、p63、p73、Bax-Luc和Puma-Luc等转染进H1299细胞中,观察各种情况下对前凋亡基因转录能力的影响;用体外转录/翻译偶联系统、免疫沉淀和Western blot方法研究iASPP与p63和p73在体外的相互作用;用细胞转染、免疫沉淀和Western blot方法研究iASPP与p63和p73在细胞内的相互作用。结果①H1299细胞转入iASPP后前凋亡基因Bax和Puma的转录能力下降,分别只有对照组的0.14倍和0.13倍;②H1299细胞转入iASPP干扰质粒后前凋亡基因Bax和Puma的转录能力增强,分别为对照组的3.58倍和4.14倍;③p63和p73转染H1299细胞后,前凋亡基因Bax和Puma启动子的转录能力增强,分别增加4.67倍和3.03倍(转染p63后)和5.90倍和3.36倍(转染p73后);④iASPP与p63、p73在体外和细胞内存在着相互作用;⑤干扰iASPP后p63和p73的蛋白表达水平不变。结论在p53缺失的H1299细胞中,iASPP是通过抑制p63/p73的转录因子的功能,从而影响前凋亡基因Bax、Puma等的转录活力,进而导致细胞凋亡变化的。
- 高兴邱实蔡云顾寿智刘泽军
- 关键词：IASPPP63P73细胞凋亡报告基因
- 人完整p53凋亡刺激蛋白家族抑制成员多克隆抗体的制备及鉴定被引量：5
- 2009年
- 目的:p53凋亡刺激蛋白(ASPP)家族可调节p53抑癌功能,其抑制成员(iASPP)具有特异性抑制p53诱导细胞凋亡的能力。为了对iASPP进行系统研究,文中报道制备完整的iASPP分子多克隆抗体的方法。方法:在完整iASPP独有的N端选择3个免疫原肽段,制备了3个多克隆抗体。用ELISA检测抗体效价,Western blot比较3个抗体检测内源性抗原的效果,并用体外转录翻译系统制备的完整iASPP蛋白作为对照标准。结果:1号抗体效价>1∶32000,2号和3号抗体效价>1∶16000。Western blot确定100000为完整iASPP蛋白的条带位置。结论:成功地制备了iASPP的多克隆抗体,为深入研究完整iASPP提供了有用的工具。
- 蔡云高兴辛海明陈杰扬新刘泽军
- 关键词：多克隆抗体免疫印迹
