宋钢
- 作品数：9 被引量：23H指数：4
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- 相关领域：生物学化学工程医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 人组织型纤溶酶原激活剂cDNA糖基化位点突变体的构建
- 1998年
- 构建人组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｕｅｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ糖基化位点突变体，为ｔ－ＰＡｃＤＮＡ在Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ酵母表达系统中的表达提供条件。方法运用ＤＮＡ重组技术，构建ｐＡＨＲ、ｐＡＲＨ质粒，然后应用改良的寡核苷酸诱导定位突变技术，构建ｐＭＡＨＲ、ｐＭＡＲＨ质粒，并用限制性核酸内切酶鉴定、核酸序列分析证实。结果琼脂糖凝胶电泳显示了特异的片段，序列分析证实获得的ｐＭＡＨＲ为Ａｓｎ１１７和Ａｓｎ１８４位点突变的阳性克隆，ｐＭＡＲＨ为Ａｓｎ４４８位点突变的阳性克隆。结论成功地构建了ｔ－ＰＡｃＤＮＡ糖基化位点突变体。
- 宋钢官孝群宋后燕
- 关键词：CDNA突变体纤溶酶原激活剂
- 低免疫原性的新型葡激酶ΔNMSak在大肠杆菌中的高效表达和分离纯化被引量：3
- 2000年
- 为了降低野生型葡激酶 (wild- type staphylokinase,wt- Sak)的免疫原性 ,对已构建的葡激酶N端缺失突变体 (ΔNSak) c DNA进行改造 ,将其主要的抗原决定簇编码序列突变为丙氨酸密码子 .该突变体 (ΔNMSak) c DNA与原核表达载体 p LY- 4重组后 ,转化大肠杆菌 JF1 1 2 5.经温度诱导 ,ΔNMSak获得高效表达 ,重组蛋白占全菌总蛋白的 60 % ,以包涵体形式存在 .包涵体经洗涤 ,8mol/L尿素溶解 ,稀释复性 ,离子交换色谱一步分离至电泳纯 ,纯度达 95%以上 ,分子量与理论值相符 ,比活性 8.5× 1 0 4 HU/mg.经 ELISA法、发色底物法测定 ,ΔNMSak与 wt- Sak制备的兔抗wt- Sak抗血清的免疫反应性显著降低 ,经抗血清温育后 ,wt- Sak活性下降程度远高于 ΔNMSak.ΔNMSak、wt- Sak分别免疫豚鼠 ,以 ELISA法测定豚鼠血清中相应抗体的效价 ,ΔNMSak组的抗体效价明显低于 wt- Sak组 ,表明 ΔNMSak的免疫原性显著下降 .
- 宋钢莫炜宋后燕
- 关键词：葡激酶免疫原性纯化大肠杆菌
- 重组葡激酶N端缺失突变体对纤溶酶原的激活作用被引量：4
- 2000年
- 目的 比较重组葡激酶（ＳＡＫ）及其Ｎ端缺失突变体（ΔＮＳＡＫ）对纤溶酶原（ＰＬＧ）激活作用的酶动力学常数，探讨ＳＡＫＮ端结构与功能的关系，以进一步改造ＳＡＫ分子。方法 采用酶反应动力学方法结合生物传感器测定ＳＡＫ、ΔＮＳＡＫ与ＰＬＧ、纤溶酶（ＰＬＭ）作用的动力学常数。结果 两者与ＰＬＭ形成的复合物催化ＰＬＧ的Ｋｍ值分别为６．２９、４．６μｍｏｌ／Ｌ，Ｋｃａｔ值分别为０．７２５ｓ－１、０．３１２ｓ－１；两者与ＰＬＧ的亲和系数分别为２．６４×１０８、１．０７×１０９；与ＰＬＭ的亲和系数分别为１．３２×１０９、３．６７×１０８。结论 ＳＡＫＮ端１８个氨基酸对ＳＡＫ·ＰＬＧ复合物及ＳＡＫ·ＰＬＭ酶催化活性中心的形成无明显影响。
- 叶立文宋钢宋后燕
- 关键词：葡激酶突变体纤溶酶原
- 用计算机模型研究葡激酶与人微小纤溶酶原的相互作用被引量：4
- 1999年
- 利用计算机同源模建预测人微小纤溶酶原的三维结构，与葡激酶Ｘ射线晶体结构进行了分子对接，研究了葡激酶与微小溶酶原的结合区，并设计了分子量小、低抗原性的新型葡激酶分子。
- 宋钢宋后燕茅翔
- 关键词：葡激酶分子设计计算机模型
- 人纤溶酶原结构和功能研究进展被引量：5
- 1999年
- 人纤溶酶原(plasminogen,Plg)是纤溶系统的主要成分,与体内多种生理、病理过程密切相关。本文综述Plg基因及其编码的蛋白质的结构与功能,由此进一步阐述其临床意义。
- 宋钢
- 关键词：纤溶酶原基因表达基因调控
- 人微小纤溶酶原活性中心丝氨酸突变体基因在毕赤酵母中的表达被引量：1
- 2000年
- 用PCR方法将编码人微小纤溶酶原 (microplasminogen ,mPlg)活性中心Ser的密码子置换为Ala密码子 ,突变体cDNA与分泌型酵母表达载体 pHIL D8重组 ,构成受醇氧化酶基因 (AOX1)的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒 ,转化GS115酵母菌 ,经表型筛选、PCR扩增筛选阳性克隆 ,以甲醇诱导表达 ,Mm Plg分泌至培养液 ,经Westernblot证实。培养液经离心 ,上清与重组葡激酶 (Staphylokinase,Sak)孵育后 ,以酪蛋白 琼脂糖平板溶圈法、发色底物法检测 ,MmPlg未显示纤溶活性。
- 宋钢官孝群莫炜宋后燕
- 关键词：毕赤酵母抗血栓药物
- 人微小纤溶酶原基因在甲醇营养型酵母中的表达被引量：6
- 1999年
- 用ＰＣＲ方法扩增人微小纤溶酶原（Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ，ｍｐｌｇ）ｃＤＮＡ，与分泌型酵母表达载体ｐＨＩＬＤ８重组，构成受醇氧化酶基因（ＡＯＸ１）的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒，然后转化ＧＳ１１５酵母菌，经表型筛选、ＰＣＲ扩增筛选阳性克隆，然后以甲醇诱导表达，ｍｐｌｇ分泌至培液，以酪蛋白琼脂糖平板溶圈法、发色底物法检测，ｍｐｌｇ显示出纤溶活性。
- 宋钢官孝群宋后燕
- 关键词：酵母
- 一种新型葡激酶分子的设计基因构建表达纯化及性质研究被引量：2
- 2000年
- 在葡激酶构效关系的研究过程中发现 ,葡激酶易形成二聚体 ,甚至多聚体 ,不利于葡激酶的临床应用。为了探究聚合体的形成机制以研制不易聚合的新型葡激酶分子 ,在葡激酶X射线晶体衍射结构模型的基础上 ,采用分子对接软件GRAMMV1 0 3,以高分辨率整体对接方式预测了葡激酶二聚体可能的结合区。结合区主要有两种可能的形成方式 ,通过强疏水相互作用及氢键结合。根据模型设计了旨在降低聚合能力的葡激酶突变体RGD -Sak ,将F1 1 1置换为D1 1 1 ,并且改变K1 0 9为R1 0 9,恰好使分子中形成RGD结构 ,使新型分子还可能具有抑制血小板聚集作用。利用定点突变及DNA重组技术 ,构建了RGD -Sak基因 ,并利用大肠杆菌原核表达系统进行了高效表达。RGD -Sak以包涵体形式存在 ,包涵体经洗涤 ,8mol/L尿素溶解 ,稀释复性 ,离子交换色谱一步分离得到电泳纯的RGD -Sak ,纯度达 95%以上 ,分子量与理论值相符 ,比活性 5× 1 0 4 HU/mg。RGD -Sak与纤溶酶形成的复合物催化纤溶酶原的Km、Kcat值分别为 1 2 40 μmol/L、 0 81s- 1 。RGD -Sak显示了很弱的聚合能力。此研究为研制防止二聚体形成的新型葡激酶分子打下了基础。
- 宋钢于敏莫炜宋后燕
- 关键词：葡激酶分子设计定点突变基因构建溶栓药物
