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一种新穿膜肽的构建、表达及其活性检测被引量：10: 2007年; 通过对穿膜肽TAT-PTD构效关系的分析和结构改造,构建能有效进入血脑屏障且低毒的新穿膜肽。该研究用分子克隆技术构建出表达型载体pET28a-T1-GFP,重组质粒在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达融合蛋白His-T1-GFP,经组氨酸亲和层析纯化后,用荧光显微镜和免疫组化的方法来检测His-T1-GFP在活体动物小白鼠体内的跨膜递送作用。经测序证实成功构建了表达型载体pET28a-T1-GFP,融合蛋白His-T1-GFP在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达率为20%。经组氨酸亲和纯化,得到纯度达85%的融合蛋白。SDS-PAGE和Western Blotting显示纯化蛋白为His-T1-GFP,动物实验表明融合蛋白His-T1-GFP能够有效跨过血脑屏障,主要分布在大脑皮层和海马回。该研究成功地构建了一种新的穿膜肽-T1,为其携带有生物活性的大分子物质到达脑部进行蛋白治疗奠定了基础。; 王怡蔡绍晖姜丽娟李校堃; 关键词：穿膜肽绿色荧光蛋白血脑屏障

新穿膜融合蛋白His-T1-绿色荧光蛋白的跨膜效率及其对细胞存活的影响被引量：1: 2008年; 目的研究穿膜融合蛋白His-T1-绿色荧光蛋白（GFP）的跨膜效率及其对细胞存活的影响。方法以浓度为500mg·L^-1的His-T1-GFP与人鼻咽癌CNE2或大鼠肾小管上皮NRK52E细胞孵育6h，应用荧光显微镜观察His-T1-GFP跨膜进入细胞的情况。应用多功能酶标仪检测细胞荧光强度，研究His-T1-GFP跨膜的动力学因素：以浓度为500mg·L-1的His-T1-GFP与CNE2或NRK52E细胞孵育10min至24h，观察孵育时间对穿膜作用的影响；以浓度为25mg·L^-1至1．0g·L^-1的His-T1-GFP与两种细胞孵育6h，观察蛋白浓度对跨膜效率的影响；以浓度为500mg·L^-1的His-T1-GFP与两种细胞分别在4℃和37℃的条件下孵育6h，观察温度对蛋白跨膜效率的影响。用细胞乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒和MTr法来评价5．0g·L^-1浓度的His-T1-GFP对细胞存活的影响。结果在一定浓度范围内，His-T1-GFP能够有效穿透CNE2和NRK52E细胞膜，且对NRK52E细胞的跨膜效率明显高于His-TAT-GFP。His-T1-GFP在10min内就能有效跨膜进入细胞，并且在6h内进入细胞的量与时间成正相关。在一定浓度范围（25mg·L^-1-1．0g·L^-1）内，该蛋白进入细胞的量与自身浓度成正相关，而在4℃时该蛋白仍具有跨膜能力。当其终浓度高达5．0g·L^-1时，对CNE2和NRK52E两种细胞几乎无毒性作用。结论His-T1-GFP蛋白是一种跨膜效率高且低毒的穿膜融合蛋白。; 王怡林海环杨静姜丽娟李校堃; 关键词：穿膜肽融合蛋白细胞膜通透性细胞毒性

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姜丽娟

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