陈曦
- 作品数：75 被引量：198H指数：6
- 供职机构：首都医科大学附属北京胸科医院更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项北京市自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 炎性小体中凋亡相关斑点样蛋白抗结核分枝杆菌感染作用的研究被引量：1
- 2017年
- 目的分析核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎性小体在结核分枝杆菌（ Mycobacterium tuberculosis, MTB）感染小鼠中的免疫保护作用。方法选取无免疫缺陷的野生型（widetype，WT）C57BL／6小鼠、半胱天冬酶-1-/-小鼠、ASC-/-小鼠及NLRP3-/-小鼠用于体内MTB感染实验，各种系小鼠骨髓和腹腔巨噬细胞用于体外MTB感染实验。体内感染实验小鼠分为2组：第1组中4种小鼠各感染30只，用于细菌载量分析、细胞因子检测及生存期评价；第2组中4种小鼠各感染15只，用于组织病理学分析及肺组织细胞流式分析；实验第1、2、3、4周时各种系小鼠各取1只未感染小鼠作为对照。检测感染小鼠的生存率及肺组织匀浆中细菌载量；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法，测定未感染野生型小鼠、感染小鼠肺组织匀浆中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-12p40（IL-12p40）、IL-1β和γ-干扰素（IFN-γ）水平；应用流式细胞术分析小鼠感染后肺组织中的浸润细胞组分及细胞坏死情况，并以ELISA法分析支气管灌洗液和血清中坏死相关因子高迁移率族蛋白1（HMGB-1）和IL-1α的分泌情况；对感染肺组织进行组织病理学分析；采用蛋白质免疫印迹检测半胱天冬酶-1的成熟情况；采用ELISA法测定巨噬细胞培养上清中的IL-1β水平。结果感染MTB24h后，野生型小鼠骨髓巨噬细胞培养上清中IL-1β水平明显高于半胱天冬酶-1-/-小鼠、ASC-/-小鼠及NLRP3-/-小鼠[分别为：（316．29±4．64）pg／ml、（21．30±2．37）pg／ml、（22．99±0．46）pg／ml、（32．61±0．22）pg／ml；F=30．53，P〈0．01]；野生型小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中IL-1β水平也明显高于半胱天冬酶-1-/-小鼠、ASC-/-小鼠及NLRP3-/-小鼠[分别为：（2970．36±11．53）pg／ml、（130．48±2．52）pg／ml、（120．24±3．43）pg／ml、（121．66±2．48�
- 陈曦姜广路贾红彦张宗德
- 关键词：结核自身免疫抗生作用动物
- 非结核分枝杆菌的基因组学
- 2017年
- 非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）广泛存在于自然界如土壤、水、尘埃、鱼、家畜及家禽中，其中约三分之一是引起动物或人NTM病的机会性致病菌，严重时可造成感染宿主死亡。人体经环境或动物感染NTM而患病，水和土壤是重要的传播途径，但人与人之间传播尚未得到证实。
- 陈曦李自慧潘丽萍郑晓静杜凤娇黄银霞张宗德
- 关键词：非结核分枝杆菌基因组学动物感染NTM病致病菌机会性
- 对氨基水杨酸（PAS）耐药与结核分枝杆菌thyA基因突变的研究被引量：4
- 2008年
- 目的 检测结核分枝杆菌临床分离株对氨基水杨酸（PAS）耐药和胸苷酸合成酶基因（thyA）突变的关系，以探讨结核分枝杆菌PAS耐药的分子机制。方法95株结核分枝杆菌临床分离株中的51株PAS敏感株和44株PAS耐药株的PAS耐药相关基因thyA基因进行PCR扩增，扩增产物纯化后进行序列测定，与结核分枝杆菌标准株H37Rv的野生型岫，A基因序列进行对比，判断这些临床分离株的thyA基因有无突变。结果51株PAS敏感株thyA基因未检出突变。44株PAS耐药株中有16个临床分离株的thyA基因检测到突变，突变检出率为36．4％（16／44）。突变类型包括置换、颠换、插入、缺失，均为单碱基改变或单碱基缺失，其中2株为thyA基因2个位点联合突变。结论结核分枝杆菌tyA基因突变是其产生PAS耐药的重要原因之一。结核分枝杆菌胸苷酸合成酶是PAS作用的重要靶位。
- 张宗德赵雁林李自慧贾红艳刘宇红陈曦刘忠泉杜博平古淑香邢爱英马玙
- 关键词：胸苷酸合成酶抗药性
- 结核分枝杆菌休眠菌复苏初期与活跃期的差异表达基因分析被引量：4
- 2008年
- 目的 寻找休眠结核分枝杆菌复苏的关键基因，探讨结核分枝杆菌复苏的机制。方法 取7H9培养20天的H37Rv作为对数生长期的活跃结核分枝杆菌，并提取RNA。取一部份对数生长期的H37Rv加入亚甲兰作为无氧标志，37℃密封培养，无氧状态下生长的H37Rv会随着培养基中的氧气耗尽而进入休眠状态，继续无氧培养1个月的陈旧菌即为休眠菌，取休眠菌，加入适量5个复苏因子蛋白质组合，37℃有氧培养三天，提取RNA。用mRNA纯化试剂盒纯化RNA。利用抑制性消减杂交（SSH）技术分析复苏因子蛋白刺激三天的休眠结核分枝杆菌和对数生长期结核分枝杆菌的基因组mRNA的表达差异。并通过基因克隆技术、基因测序和序列分析，寻找差异表达基因。结果我们通过SSH杂交，以活跃结核分枝杆菌cDNA为Tester的正相杂交和以复苏因子蛋白刺激三天的休眠结核分枝杆菌cDNA为Tester的反相杂交的各自Tester高表达或特异性表达的片段都得到了选择性扩增，杂交产物经连接pTA2载体、转化DH5α、蓝白斑筛选，正相获得78个阳性菌落，反相获得46个阳隆菌落。阳性单个菌落经液体LB培养基培养，以菌液为模板，T7、M13为引物，扩增插入片段，能扩增到明显的带，且带大于350pb的为阳性。则正相得到66个阳性扩增带，反相得到39个阳性扩增带。这105个阳性扩增带的菌液经测序分析，将序列完全相同的特异性序列筛选合并，正相获得41个不同的特异性序列，反相获得32个不同的特异性序列。再去掉因消减杂交不完全而使正、反相中都获得的相同序列，则正相有30个特异性序列，反相有21个特异性序列。51个序列通过Genbank检索，因有不同序列检索得到对应同一基因的情况，因此，正相30个特异性序列经检索后对应22个不同的基因，反相21个特异性序列经检索后对应9个不同的基因。在我们的�
- 刘忠泉张宗德邢爱英陈曦李自慧古淑香贾红艳杜博平马玙
- 关键词：抑制性消减杂交基因表达
- 炎性小体中凋亡相关斑点样蛋白抗结核分枝杆菌感染作用的研究
- 2017年
- 目的分析核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎性小体在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染小鼠中的免疫保护作用。方法选取无免疫缺陷的野生型（widetype，WT）C57BL／6小鼠、半胱天冬酶-1^-/-小鼠、ASC^-/-小鼠及NLRP3^-/-小鼠用于体内MTB感染实验，各种系小鼠骨髓和腹腔巨噬细胞用于体外MTB感染实验。体内感染实验小鼠分为2组：第1组中4种小鼠各感染30只，用于细菌载量分析、细胞因子检测及生存期评价；第2组中4种小鼠各感染15只，用于组织病理学分析及肺组织细胞流式分析；实验第1、2、3、4周时各种系小鼠各取1只未感染小鼠作为对照。检测感染小鼠的生存率及肺组织匀浆中细菌载量；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法，测定未感染野生型小鼠、感染小鼠肺组织匀浆中的肿瘤坏死因子-α（TNF—α）、白细胞介素-12p40（IL-12p40）、IL-1p和γ-干扰素（IFN-γ）水平；应用流式细胞术分析小鼠感染后肺组织中的浸润细胞组分及细胞坏死情况，并以ELISA法分析支气管灌洗液和血清中坏死相关因子高迁移率族蛋白1（HMGB-1）和IL-1α的分泌情况；对感染肺组织进行组织病理学分析；采用蛋白质免疫印迹检测半胱天冬酶-1的成熟情况；采用ELISA法测定巨噬细胞培养上清中的IL-1β水平。结果感染MTB24h后，野生型小鼠骨髓巨噬细胞培养上清中IL．1B水平明显高于半胱天冬酶-1^-/-小鼠、ASC^-/-小鼠及NLRP3^-/-小鼠[分别为：（316．29±4．64）pg／ml、（21．30±2．37）pg／ml、（22．99±0．46）pg／ml、（32．61±0．22）pg／ml；F=30．53，P〈0．01]；野生型小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中IL-1β水平也明显高于半胱天冬酶-1^-/-小鼠、ASC-/-小鼠及NLRP3^-/-。小鼠[分别为：（2970．36±11．53）pg／ml、（130．48±2．52）pg／ml、（120．24±3．43）pg／ml、（121�
- 陈曦姜广路贾红彦张宗德
- 关键词：自身免疫抗生作用
- 结核分枝杆菌休眠复苏期与活跃期的差异表达基因分析被引量：6
- 2008年
- 目的寻找休眠结核分枝杆菌复苏的关键基因，探讨结核分枝杆菌复苏的机制。方法取改良7H9培养基培养20d的结核分枝杆菌标准株H37Rv作为对数生长期的活跃结核分枝杆菌，提取其RNA。将一部分该菌株在37℃密封无氧培养45d左右，加入亚甲蓝作为无氧标志，即获得休眠菌。向休眠菌中加入复苏促进因子，37℃有氧培养3d，提取休眠复苏期结核分枝杆菌的基因组RNA。用DNA酶处理RNA并回收RNA，用mRNA纯化试剂盒纯化RNA。利用抑制性消减杂交（Suppression subtractive hybridization，SSH）技术分析休眠复苏期和活跃期结核分枝杆菌的基因组mRNA的表达差异，并通过基因克隆、测序和序列分析，寻找差异表达基因。实时荧光定量PCR鉴定差异表达基因。结果以活跃期结核分枝杆菌cDNA为检测子的正相杂交和以休眠复苏期结核分枝杆菌cDNA为检测子的反相杂交各自高表达或特异性表达的片段都得到了选择性扩增，杂交产物经连接pTA2载体、转化至大肠杆菌DH5α和蓝白斑筛选，正相杂交获得78个阳性菌落，反相杂交获得46个阳性菌落。阳性单个菌落经液体LB培养基培养，以菌液为模板，T7、M13为引物，扩增插入片段，能扩增到明显的条带，且〉350bp的条带为阳性。正相杂交得到66个阳性扩增带，反相杂交得到39个阳性扩增带。这105个阳性扩增带的菌液经测序分析，则正相有30个特异性序列，反相有21个特异性序列。将这51个序列通过Genbank检索，因有不同序列对应同一基因，最后正相获得了20个活跃结核分枝杆菌特异性表达或高表达的功能基因，反相获得了7个休眠复苏期结核分枝杆菌特异性表达或高表达的功能基因，根据其功能不同分为8大类。经实时荧光定量PCR分析，7个休眠复苏期结核分枝杆菌特异性表达或高表达功能基因的表达量均为活跃结核分枝杆菌的该基因表达�
- 刘忠泉张宗德邢爱英陈曦李自慧古淑香贾红艳杜博平马玙
- 关键词：基因抑制性消减杂交
- 改良单叠氮丙啶-荧光定量PCR法的建立及其检测抗结核药物活性的价值
- 2020年
- 目的建立改良的单叠氮丙啶(propidium monoazide x,PMAxx).荧光定量PCR(qPCR)鉴定MTB活菌和热灭活菌的方法,并探讨PMAxx-qPCR进行抗结核药物体外活性检测的价值。方法通过活菌和热灭活菌优化PMAxx针对MTB终点H37Rv的预先条件,包括曝光时间,暗孵育时间,PMAxx浓度,以及靶标DNA片段长度等。通过量效曲线和建立循环阈值(Cq)与菌负荷的标准曲线,应用PMAxx-qPCR法计算测定异烟肼(INH),利福平(RFP)的体外抗菌活性,评价检测敏感度,并分别与微孔板Alamar Blue(MABA)法和菌落形成单位(CFU)计数法进行比较,菌落计数采用独立样本t检验进行统计分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果当细菌负荷设定为10^(7)CFU/ml时,在PMAxx浓度为10μmol/L,暗孵育10 min后曝光15 min可有效鉴别活菌,死菌(ΔCq死-话=6.772±0.453),且使用>200bp靶标片段可更有效地反映活菌.死菌的差异。PMAxx-qPCR方法在药物作用后3d与MABA法--致性良好的最低抑菌浓度(MIC)检测结果(INH:0.049-0.076μg/ml与0.032-0.064μg/ml,t=0.782,P=0.491;RFP:0.10^(2)~0.145μg/ml与0.051~0.079μg/ml,t=2.828,P=0.066)。定量标准曲线Cq与菌计数(IgCFU1ml)星示良好的线性关系(R^(2)=0.9863),最低检测限为102 CFU/ml,且.PMAxx-qPCR方法和CFU计数方法测算16×MIC、8×MIC、4×MIC、2×MIC和1×MIC浓度的INH的抗菌计数分别为(4.376±0.344)和(4.325±0.318).(4.232±0.106)和(3.936±0.194).(4.122±0.277)和(3.874±0.105).(3.950±0.113)和(3.675±0.250).(3.770±0.228)和(3.618±0.257)CFU/ml,两种方法计数比较差异均无统计学意义(t值分别为0.165、1.894、1.186、1.419和0.626,P值分别为0.880、0.199、0.357,0.292和0.595),而16×MIC、8×MIC、4×MIC、2×MIC和1×MIC浓度的RFP的抗菌计数分别为(4.577±0.216)和(4.675±0.250).(4.445±0.054)和(4.374±0.675).(3.627±0.173)和(3.154±0.076).(1.946±0.359)和(2.159土0.083).(1.552±0.423)和(0.960±0.202)CFU/ml,两种方法计数比较差异均无统计学意义(t值分别为0.469,0.199
- 张静陈曦王彬付雷陆宇陈效友
- 关键词：抗结核药微生物敏感性试验
- 北京市昌平区某高校大学新生结核潜伏感染调查被引量：3
- 2016年
- 目的调查大学新生结核潜伏感染情况，以便采取预防性措施。方法2010年10月随机纳入北京市昌平区某高校入学新生TST≥10mm的健康受试者420例，应用ELISPOT检测经抗原刺激后分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞（即斑点形成细胞，SFCs）数量，并对ELISPOT阳性者进行为期3年的结核感染发病情况监测。结果ELISPOT检测LTBI总的阳性率为41．2％，在BCG接种（阳性率41．5％）和未接种（阳性率40．0％）中差异无统计学意义（χ^2=0．064，P=0．447），在TST直径10-14、15-19和≥20mm组间（37．6％、45．4％和64．3％）差异有统计学意义（χ^2=8．408，P=0．015），173例未治疗的ELISPOT＋／TST＋者经3年的ATB监测，发病率为0。结论北京市昌平区某高校大学新生LTBI比率高，但仅以ELISPOT和TST双阳性者为预防性治疗指标，尚不足够。
- 杜凤娇张治国高铁杰刘忠泉陈曦曹廷明贾红彦邢爱英杜博平张宗德
- 关键词：酶联免疫斑点技术结核菌素皮肤试验
- 结核分枝杆菌glcB基因原核表达载体的构建、表达和纯化
- 2009年
- 目的构建结核分枝杆glcB基因原核表达载体，并进行表达，纯化。方法用PcR扩增结核分枝杆菌glcB基因，并克隆入pTA2质粒。测序正确后，再亚克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：glcB重组体。结果以重组体转化BL21（DE3）后，经0．4mM异丙基硫代-β．D．半乳糖苷（IPTG）诱导，表达出分子量为92KD重组蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中，表达量占全菌蛋白质的50％。经Ni-NTA柱纯化，获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：glcB，并获得GIcB重组蛋白，为血清学诊断活动性结核病奠定了基础。
- 陈曦贾红彦古淑香李自慧刘忠泉郑小静邢爱英杜博平张继增张宗德
- 关键词：分枝杆菌
- 对氨基水杨酸(PAS)耐药与结核分枝杆菌thyA基因突变的研究
- 对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid,PAS)是二十世纪四十年代发现的有效抗结核药物之一(Lehmann,1946)。PAS可以加强异烟肼和链霉素的活性．并且广泛用于抗结核化疗的联合方案中(Of...
- 张宗德赵雁林贾红艳刘宇红刘忠泉李自慧陈曦邢爱英杜博平古淑香马玙
- 文献传递
