李建华
- 作品数：6 被引量：30H指数：3
- 供职机构：西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划公益性行业(农业)科研专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 奶山羊POU1F1基因的克隆、生物信息学分析以及原核表达
- 本研究通过提取奶山羊垂体组织总RNA,采用反转录RT-PCR的方法,试验克隆得到876bp长的奶山羊垂体特异性转录因子POU1F1基因野生型的编码区序列,同时得到一个迄今为止尚未报导的647bp新转录本,对所得到的这两个...
- 李建华
- 关键词：奶山羊POU1F1克隆生物信息学分析原核表达
- 文献传递
- 西农萨能羊BTN基因RNA干扰序列筛选及重组腺病毒载体构建与鉴定
- ＜正＞引言嗜乳脂蛋白（BTN）作为乳腺特异表达蛋白,是一种带有胞质C-端尾巴的跨膜糖蛋白,集中分布在乳腺上皮细胞顶层质膜。BTN仅在泌乳期乳腺中特异表达,而且受乳腺不同的生理阶段影响。在牛及小鼠上的研
- 赵旺生罗军王伟张晓李建华
- 关键词：RNA干扰腺病毒载体
- 文献传递
- 西农萨能羊FAS基因shRNA序列筛选及其腺病毒载体的构建被引量：8
- 2010年
- 山羊脂肪酸合酶（Fatty acid synthase,FAS）是脂肪酸合成的关键酶,对乳腺短、中链脂肪酸合成起重要调控作用。设计了shRNA-5544、shRNA-5936s、hRNA-6132 3条针对FAS基因不同区域的小发夹RNA（Short hairpin RNA,shRNA）及一条阴性对照序列shRNA-NC,并构建表达这4条shRNA序列的入门载体及其靶基因与红色荧光蛋白基因的融合表达载体,二者共转染HEK 293细胞进行有效序列筛选,结果显示shRNA-5544和shRNA-5936序列具有明显的干扰效果。在LR Clonase-Ⅱ重组酶作用下,分别将pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-5544、pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-5936及pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-NC入门载体与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST进行LR重组,经氨苄青霉素及氯霉素抗性筛选后成功获得3个重组腺病毒载体,ScaⅠ酶切鉴定及测序分析证实所构建的重组腺病毒载体中插入序列与设计序列一致。重组腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,利用Lipofectamine 2000转染HEK 293细胞,10~12 d后收集病毒,在HEK 293细胞中反复扩增3次后,获得高滴度的重组腺病毒,利用TCID50法测定重组腺病毒滴度分别为6×108PFU/mL（表达shRNA-5544序列）、5×108PFU/mL（表达shRNA-5936序列）及6×108PFU/mL（表达shRNA-NC序列）,为进一步在原代培养的山羊乳腺上皮细胞中进行FAS基因的RNA干扰研究奠定基础。
- 王伟罗军赵旺生李建华张晓王龙坛
- 关键词：乳腺SHRNA腺病毒载体
- 奶山羊POU1F1基因的克隆、生物信息学分析及原核表达
- ＜正＞引言垂体特异性转录因子POU1F1（POU domain,class1,transcripton factor1）,也叫PIT-1,是POU基因家族的成员之一,是重要的组织特异性转录因子,主要在垂体前叶腺中表达。P...
- 李建华罗军张晓王伟郝娟赵旺生
- 关键词：关中奶山羊POU1F1克隆原核表达
- 文献传递
- 奶山羊POU1F1基因CDs区的克隆、分析及原核表达被引量：5
- 2010年
- 【目的】克隆奶山羊垂体特异性转录因子POU1F1基因CDs区,并对其进行生物信息学分析和原核表达。【方法】采集关中奶山羊垂体组织,提取其总RNA,根据绵羊POU1F1基因序列,利用反转录RT-PCR克隆POU1F1基因CDs区,对其进行生物信息学分析,并构建原核表达载体pET-32a-POU1F1,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达。【结果】关中奶山羊POU1F1基因(GenBank登陆号:FJ547813)开放读码框由876个碱基组成,编码291个氨基酸,基中包含1个POU-specific结构域(从第124～198个氨基酸)和1个Homeobox结构域(从第214～276个氨基酸);奶山羊POU1F1基因CDs区核苷酸序列与绵羊(NM_001009350)、牛(NM_174579)、人(NM_000306)和小鼠(NM_008849)的同源性分别为98%,97%,91%和86%,其氨基酸序列与绵羊、牛、人和小鼠的同源性分别为98%,98%,96%和92%;成功构建了重组质粒pET-32a-POU1F1的原核表达系统,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白His-POU1F1。【结论】POU1F1基因编码的功能氨基酸在奶山羊、绵羊、牛、人和小鼠上高度保守,推测奶山羊POU1F1基因与其他物种的POU1F1基因具有相似的功能。
- 李建华罗军张晓樊睿王伟郝娟赵旺生
- 关键词：关中奶山羊POU1F1克隆生物信息学分析原核表达
- 西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因启动子的克隆及活性测定被引量：17
- 2010年
- 【目的】克隆测定西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因(fatty acid synthase,FAS)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为奶山羊FAS基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】根据牛和人脂肪酸合酶基因启动子的同源序列以及西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因5′UTR区域,分别设计上、下游引物,以西农萨能奶山羊全血DNA为模板克隆启动子序列。依据生物信息学分析结果重设引物,将FAS启动子基因分段克隆并连接到荧光素酶表达载体PGL-3,与Psv-β-半乳糖苷酶对照载体共转染293、MCF-7细胞,进行荧光素酶活性检测和β-半乳糖苷酶的活性检测。【结果】FAS基因启动子序列全长2640bp,与牛、人FAS启动子序列同源性90%以上,包括数个潜在SP1、Ets、LSF等转录因子结合位点和CCAAT框、GC框。-1040—-340bp处可能包含启动子活性中心,通过启动子缺失片段试验将活性中心范围缩小至-721—-540bp之间。【结论】通过克隆FAS基因启动子区域,分析表明启动子前端存在负调控元件,找出了启动子最小活性中心。
- 张晓罗军李建华赵旺生王伟
- 关键词：西农萨能奶山羊基因克隆活性测定
