王伟
- 作品数：9 被引量：58H指数：4
- 供职机构：西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划公益性行业(农业)科研专项转基因生物新品种培育专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 奶山羊短链脂肪酸受体GPR41 CDS区的克隆及组织表达分析
- 随着生活水平的提高，人们对肉、奶等食品的需求不仅是色、香、味，更是营养价值的全面提高。转基因技术在改良家畜的肉质、产奶、产毛等经济性状方面具有不可替代的优势，目前己成为畜禽抗病育种及生产性能改良的重要手段。了解家畜脂代谢...
- 孙雨婷罗军王伟赵旺生石恒波
- 关键词：奶山羊转基因克隆
- 文献传递
- 西农萨能羊FAS基因shRNA序列筛选及其腺病毒载体的构建被引量：9
- 2010年
- 山羊脂肪酸合酶（Fatty acid synthase,FAS）是脂肪酸合成的关键酶,对乳腺短、中链脂肪酸合成起重要调控作用。设计了shRNA-5544、shRNA-5936s、hRNA-6132 3条针对FAS基因不同区域的小发夹RNA（Short hairpin RNA,shRNA）及一条阴性对照序列shRNA-NC,并构建表达这4条shRNA序列的入门载体及其靶基因与红色荧光蛋白基因的融合表达载体,二者共转染HEK 293细胞进行有效序列筛选,结果显示shRNA-5544和shRNA-5936序列具有明显的干扰效果。在LR Clonase-Ⅱ重组酶作用下,分别将pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-5544、pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-5936及pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-NC入门载体与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST进行LR重组,经氨苄青霉素及氯霉素抗性筛选后成功获得3个重组腺病毒载体,ScaⅠ酶切鉴定及测序分析证实所构建的重组腺病毒载体中插入序列与设计序列一致。重组腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,利用Lipofectamine 2000转染HEK 293细胞,10~12 d后收集病毒,在HEK 293细胞中反复扩增3次后,获得高滴度的重组腺病毒,利用TCID50法测定重组腺病毒滴度分别为6×108PFU/mL（表达shRNA-5544序列）、5×108PFU/mL（表达shRNA-5936序列）及6×108PFU/mL（表达shRNA-NC序列）,为进一步在原代培养的山羊乳腺上皮细胞中进行FAS基因的RNA干扰研究奠定基础。
- 王伟罗军赵旺生李建华张晓王龙坛
- 关键词：乳腺SHRNA腺病毒载体
- 腺病毒介导的shRNA对奶山羊乳腺上皮细胞嗜乳脂蛋白基因表达的影响
- 嗜乳脂蛋白(BTN)作为乳腺特异表达蛋白，其命名来源于希腊术语‘butyros’和‘philos'以此反映它们与乳脂球形成的密切关系。本研究通过包装扩繁好的腺病毒感染乳腺上皮细胞，检测细胞内脂肪酸代谢相关基因的表达情况，...
- 赵旺生罗军王伟郝娟孙雨婷
- 关键词：基因表达奶山羊乳腺上皮细胞脂肪酸
- 文献传递
- 奶山羊POU1F1基因的克隆、生物信息学分析及原核表达
- ＜正＞引言垂体特异性转录因子POU1F1（POU domain,class1,transcripton factor1）,也叫PIT-1,是POU基因家族的成员之一,是重要的组织特异性转录因子,主要在垂体前叶腺中表达。P...
- 李建华罗军张晓王伟郝娟赵旺生
- 关键词：关中奶山羊POU1F1克隆原核表达
- 文献传递
- 奶山羊乳腺上皮细胞的分离、培养及鉴定被引量：29
- 2010年
- 应用组织块培养法和高密度培养、连续传代法建立西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞体外培养体系,通过生长曲线绘制、核型分析、免疫荧光染色(角蛋白、上皮膜抗原、波形蛋白、β-酪蛋白)、油红染色及β-酪蛋白基因的RT-PCR分析进行培养细胞鉴定。实验结果表明细胞生长曲线为典型的S型,染色体数目众数为60,细胞角蛋白、上皮膜抗原、波形蛋白、β-酪蛋白表达均呈阳性,油红染色后可见细胞质内的脂滴,且细胞表达酪蛋白mRNA。说明运用本方法培养的细胞为正常的乳腺上皮细胞,并具有一定的泌乳功能。
- 王桢罗军王伟赵旺生林先滋
- 关键词：奶山羊乳腺上皮细胞原代培养
- 西农萨能羊BTN基因RNA干扰序列的筛选及重组腺病毒载体的构建与鉴定被引量：2
- 2010年
- 【目的】构建西农萨能羊BTN基因RNA干扰的重组腺病毒载体,为研究BTN基因的功能和作用机制奠定基础。【方法】设计并合成3对针对BTN不同位点的shRNA编码序列,克隆到pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体中,并与已构建好的表达BTN的pDsRed1-C1-BTN载体共转染HEK293细胞,筛选有效的干扰序列。通过与腺病毒骨架质粒重组,制备表达干扰BTN基因的shRNA的腺病毒,经PacⅠ线性化后,在HEK293细胞中包装并扩增病毒,用TCID50法进行病毒滴度测定,获得高滴度的病毒上清液。【结果】成功构建了西农萨能羊BTN基因的RNAi腺病毒表达载体,腺病毒经包装和扩增后,病毒滴度可达到5×109PFU/mL。【结论】获得了有功能的pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA病毒重组子。
- 赵旺生罗军王伟滕炎玲王桢林先滋
- 关键词：RNA干扰腺病毒载体
- 奶山羊POU1F1基因CDs区的克隆、分析及原核表达被引量：5
- 2010年
- 【目的】克隆奶山羊垂体特异性转录因子POU1F1基因CDs区,并对其进行生物信息学分析和原核表达。【方法】采集关中奶山羊垂体组织,提取其总RNA,根据绵羊POU1F1基因序列,利用反转录RT-PCR克隆POU1F1基因CDs区,对其进行生物信息学分析,并构建原核表达载体pET-32a-POU1F1,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达。【结果】关中奶山羊POU1F1基因(GenBank登陆号:FJ547813)开放读码框由876个碱基组成,编码291个氨基酸,基中包含1个POU-specific结构域(从第124～198个氨基酸)和1个Homeobox结构域(从第214～276个氨基酸);奶山羊POU1F1基因CDs区核苷酸序列与绵羊(NM_001009350)、牛(NM_174579)、人(NM_000306)和小鼠(NM_008849)的同源性分别为98%,97%,91%和86%,其氨基酸序列与绵羊、牛、人和小鼠的同源性分别为98%,98%,96%和92%;成功构建了重组质粒pET-32a-POU1F1的原核表达系统,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白His-POU1F1。【结论】POU1F1基因编码的功能氨基酸在奶山羊、绵羊、牛、人和小鼠上高度保守,推测奶山羊POU1F1基因与其他物种的POU1F1基因具有相似的功能。
- 李建华罗军张晓樊睿王伟郝娟赵旺生
- 关键词：关中奶山羊POU1F1克隆生物信息学分析原核表达
- 西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因启动子的克隆及活性测定被引量：17
- 2010年
- 【目的】克隆测定西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因(fatty acid synthase,FAS)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为奶山羊FAS基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】根据牛和人脂肪酸合酶基因启动子的同源序列以及西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因5′UTR区域,分别设计上、下游引物,以西农萨能奶山羊全血DNA为模板克隆启动子序列。依据生物信息学分析结果重设引物,将FAS启动子基因分段克隆并连接到荧光素酶表达载体PGL-3,与Psv-β-半乳糖苷酶对照载体共转染293、MCF-7细胞,进行荧光素酶活性检测和β-半乳糖苷酶的活性检测。【结果】FAS基因启动子序列全长2640bp,与牛、人FAS启动子序列同源性90%以上,包括数个潜在SP1、Ets、LSF等转录因子结合位点和CCAAT框、GC框。-1040—-340bp处可能包含启动子活性中心,通过启动子缺失片段试验将活性中心范围缩小至-721—-540bp之间。【结论】通过克隆FAS基因启动子区域,分析表明启动子前端存在负调控元件,找出了启动子最小活性中心。
- 张晓罗军李建华赵旺生王伟
- 关键词：西农萨能奶山羊基因克隆活性测定
