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黄勇: 作品数：29 被引量：101H指数：6; 供职机构：西北工业大学生命学院空间生物实验模拟技术国防重点学科实验室更多>>; 发文基金：国家自然科学基金陕西省自然科学基金更多>>; 相关领域：医药卫生生物学农业科学轻工技术与工程更多>>

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大肠杆菌YggG与结合蛋白Era的相互作用研究被引量：1: 2009年; Era是细菌生长必须的一高度保守的GTPase。yggG是从大肠杆菌全基因组文库中钓取并克隆的Era结合蛋白基因,进一步的研究表明该基因在大肠杆菌中的表达与环境应激相关,提示yggG基因产物参与细菌的应激调控。为了阐明YggG蛋白与Era蛋白间的相互关系,利用所构建的双启动子表达载体pDH2-YggG-Ptac-Era在同一细胞中同时表达YggG与Era蛋白,并通过免疫共沉淀实验检测细菌裂解产物YggG与Era蛋白间的相互作用;在此基础上,构建并表达纯化了GST融合的Era蛋白氨基端截短肽和Era羧基端截短肽,通过GSTPull-down检测了Era不同功能区域与YggG蛋白间的相互作用。结果显示,Era/YggG复合物仅存在于同时过表达Era和YggG蛋白的细菌细胞内,不诱导Era或者不诱导YggG蛋白过表达,均检测不到Era/YggG复合物存在;纯化的GST不能Pull-down YggG蛋白,而纯化的GST融合的Era蛋白、Era氨基端截短肽及Era羧基端截短肽均可以Pull-down YggG蛋白;GST融合Era氨基端截短肽和GST融合的Era蛋白对YggG蛋白结合作用明显高于GST融合的Era蛋白羧基端截短肽。上述结果说明,YggG是一大肠杆菌Era结合蛋白,YggG与Era的氨基端和羧基端的结合活性存在差异。; 黄勇陈苏民黄庆生梅其炳; 关键词：大肠杆菌 ERA

人NK细胞体外高效扩增的实验研究被引量：10: 2008年; 目的:建立人NK细胞体外大量扩增的方法。方法:采用基因工程方法,在K562细胞上同时表达IL-15、IL-18、4-1BBL3种基因,构建特定的K562工程细胞作为刺激细胞。IL-15、IL-18基因分别与一段特殊的跨膜蛋白基因融合,4-1BBL直接跨膜表达,使这3种蛋白在K562细胞中表达后锚定于细胞膜表面。其次,以照射致死的该K562工程细胞作为刺激细胞,以人外周血单个核细胞(PBMC)为扩增培养对象,通过与IL-2的共刺激作用,使NK细胞在体外培养条件下得到大量的扩增。结果:经过21d的刺激培养后,CD56+CD3-细胞数量扩增了(520±75)倍。CD56+CD3-细胞的纯度从培养前占PBMC的7%±4%到扩增后占总细胞比例的93%±3%。PBMC中的T细胞基本上没有得到扩增,扩增后的细胞中CD3+细胞只占2%±1.2%。扩增的细胞具备了NK细胞的基本特征和生物学特性,除了CD56+CD3-外,还对扩增的NK细胞上NKG2D、NKp46、NKp44、NKp30、CD94、CD158b、CD158a、NKB1、NKAT2等标记进行了验证。细胞毒实验表明,在效应细胞∶靶细胞为5∶1时,扩增的NK细胞的杀伤率达到了95%±4%。结论:建立的NK细胞体外扩增方法,达到了较高的扩增水平,且扩增的细胞活性较好。本方法以PBMC为原始材料,能够实现NK细胞体外的大规模制备,这将为抗病毒与抗肿瘤的NK细胞免疫治疗奠定基础。; 黄庆生李琦黄勇商澎张明杰; 关键词：扩增自然杀伤细胞白细胞介素15 白细胞介素18 4-1BB配体

稳定表达肝癌相关抗原HAb18G/CD147成纤维细胞株的建立及其意义被引量：3: 2004年; 目的 :探讨将HAb1 8G全长cDNA转染成纤维细胞NIH/ 3T3的可行性及其意义 .方法 :将含有肝癌相关抗原HAb1 8G全长cDNA的真核表达载体 pcDNA3.0 /HAb1 8G利用脂质体介导法转染小鼠成纤维细胞NIH/ 3T3,G4 1 8筛选建立稳定表达阳性克隆细胞株t3T3;利用流式细胞仪、间接免疫荧光染色方法鉴定目的蛋白转染情况 ;RT PCR琼脂糖电泳、明胶酶谱分别从mRNA和蛋白水平检测转染前后HAb1 8G刺激 3T3细胞分泌基质金属蛋白酶 (MMP 2、MMP 9)的情况 .结果 :利用脂质体介导法将HAb1 8G全长cDNA转染入成纤维细胞NIH/ 3T3,G4 1 8筛选 ,流式细胞仪分析、间接免疫荧光染色证实成功建立了稳定表达HAb1 8G的阳性克隆株 ;RT PCR琼脂糖电泳证实t3T3细胞MMP 2、MMP 9mRNA转录水平较未转染前增多 ;明胶酶谱表明t3T3分泌MMPs能力较未转染前增强 .结论 :HAb1 8G全长cDNA可以稳定转染成纤维细胞 ,并能从核酸和蛋白水平诱导基质金属蛋白酶高表达。; 黄勇蒋建利周筠姚西英窦科峰陈志南; 关键词：转染成纤维细胞金属蛋白酶类

肝癌相关抗原HAb18G对小鼠成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶2、9的影响被引量：3: 2004年; HAb18G为高特异性地表达于肝癌细胞膜表面的一种膜抗原[1,2],本研究将HAb18G全长cDNA直接转染入小鼠成纤维细胞株NIH/3T3,建立高效表达HAb18G的小鼠成纤维细胞株,观察其对基质金属蛋白酶(MMPs)的分泌所产生的影响,研究肝癌易于浸润转移的机制.; 黄勇窦科峰蒋建利陈志南; 关键词：HAB18G 小鼠肝癌基质金属蛋白酶2 相关抗原鼠成纤维细胞分泌

兔抗Red蛋白抗血清的纯化及MC3T3细胞中Red蛋白表达时相的分析被引量：3: 2006年; 为了纯化兔抗Red蛋白的3种多克隆抗体,并用其研究Red蛋白在真核细胞中的表达时相,首先于30℃培养了不含目的基因的空载体(pDH2)大肠菌,经彻底裂菌后用丙酮沉淀全菌蛋白,用其在不同时间吸附3种待纯化的Red抗体,然后用间接 ELISA法及Western-blot法检测了3种抗体的效价和特异性。最后用纯化后的3种Red抗体检测三顺反子表达载体pCMV-gIbIx的3 种蛋白表达产物在MC3T3细胞中的表达时相。ELISA及Western-blot检测结果表明:3种抗血清经纯化后特异性好且效价没有受到影响,随后用纯化的抗体成功地研究了Red基因在真核细胞中的表达时相,此结果为Red重组系统在真核生物基因功能的研究中提供了必要的条件。; 张晓楠黄勇陈苏民陈南春王涛赵伟钦; 关键词：多克隆抗体

模拟失重对人自然杀伤细胞毒活性的影响被引量：4: 2009年; 目的研究模拟失重状态下人NK细胞的细胞毒活性并对其活性变化的机制进行初步的探讨。方法采用高均一性的人NK细胞作为模型,以回转细胞培养模拟失重状态。人NK细胞经历48h和72h的模拟失重后,测定其杀伤率,并在mRNA水平检测NK细胞穿孔素基因、激活性受体基因以及抑制性受体基因的表达水平。结果模拟失重48h和72h的人NK细胞,其杀伤率比对照组分别下降了16%(P<0.05)和26%(P<0.05)。通过对模拟失重72hNK细胞mRNA的定量分析,发现激活性受体NKG2D基因表达下调,抑制性受体NKG2A基因表达上调,而穿孔素基因表达没有显著性变化。经历72h模拟失重的人NK细胞,回到正常条件下培养6d后,其细胞毒活性才恢复至正常水平。结论模拟失重可以导致人NK细胞杀伤活性的下降,其原因可能与NKG2A及NKG2D受体表达的变化有关。; 黄庆生李琦黄勇商澎张明杰; 关键词：失重模拟 NK细胞细胞毒活性 NKG2D受体

Red系统三种蛋白在哺乳动物细胞核中定位表达的设计和构建被引量：3: 2008年; 目的:构建在哺乳动物细胞核中同时定位表达Red系统三种蛋白的载体。方法:通过给red基因(gam、bet和exo)的3,端分别加入由7个氨基(pro-lys-lys-lys-Arg-Lys-val)组成的核定位信号序列(nuclear localization signal,NLS)和4个甘氨酸构成的linker序列,再从λ噬菌体基因组中,通过PCR技术分别扩增到C端均都带有NLS的gam、bet和exo的DNA全长序列,将三种PCR产物依次克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,得到含3个目的基因(gam-NLS、bet-NLs和exo-NLS)的三顺反子表达载体pCMV-gNIbNIxN,转染培养的哺乳类细胞后,用作者制备并纯化的抗Red3种蛋白的抗体进行间接免疫荧光检测,观察蛋白的定位情况。结果:不带有NLS的Red3种蛋白在细胞中表达主要集中在细胞质很少进入细胞核;而带有NLS的Red3种蛋白于不同时间转染人和鼠的两种细胞后,均表达定位于细胞核中。结论:三顺反子表达载体pCMV-gNIbNIxN的成功构建为进一步探索将λ噬菌体的red系统用于哺乳动物细胞的基因替代打下基础。; 张晓楠黄勇曹蔚侯颖赵玮钦关璐媛陈苏民吴元明; 关键词：核定位信号蛋白质表达

酵母表达肌肉生长抑制素前肽发酵工艺的优化: 2009年; 突变型肌肉生长抑制素前肽(MMP)在治疗肌肉萎缩症和培育多肌肉牲畜上有着广泛的应用前景。以重组表达MMP的毕赤酵母工程菌为模式,对该工程菌在30L发酵灌中培养与诱导条件进行优化,建立该表达系统大规模发酵的最佳生产条件,以期获得最短的发酵时间和最低的生产损耗。毕赤酵母发酵过程通常分为3个阶段:分批培养(基础培养)阶段、分批补料培养阶段、诱导阶段。对发酵过程的第2与第3阶段进行了优化。通过分步提高甘油流加速度:以20mL/L·h-1的速度流加5h、以30mL/L·h-1的速度流加5h、以50mL/L·h-1速度流加14h,并通入纯氧气,维持60%的溶氧度,使甘油流加阶段的时间从常规的48h缩短至24h,即只需24h即可达到常规方法48h才能达到的菌体密度。在诱导表达阶段,通过甘油与甲醇的交替流加,同时对发酵液中甲醇含量的实时监测,保持甲醇的浓度不超过0.5%的高限,使诱导的时间从常规的72h缩短至36h,而且表达量提高了约1倍。优化后,整个发酵周期从120～148h缩短至72～80h,显著提高了MMP蛋白的生产效率。; 黄庆生李琦黄勇商澎张明杰; 关键词：发酵毕赤酵母肌肉生长抑制素

影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨被引量：5: 2008年; 目的探讨影响大肠杆菌DH5a电转化效率的几个关键但易被忽略的因素。方法于室温(25℃)用空气浴振荡和水浴振荡培养大肠杆菌DH5a,用10%(V/V)甘油-水溶液和10%(V/V)甘油-生理盐水溶液冻存所制感受态细胞。在电压2.5kV、电阻200Ω、电容25μF的条件下进行电转化,电击冰浴(0～10min)后测定转化效率。结果于25℃水浴振荡培养细菌、10%甘油-生理盐水溶液冻存感受态细胞、电转化后冰浴6min,转化效率高达1.01×1010CFU/μg DNA。结论该法适合于大肠杆菌DH5a,可获得较高的转化效率。; 张晓楠肖玉黄勇张秀敏王涛王丽关璐媛赵玮钦; 关键词：感受态细胞电穿孔

DPP-rhBMP-4m融合表达载体的构建和应用被引量：3: 2007年; 目的:构建容易去除标签蛋白的大肠杆菌融合蛋白表达载体.方法:PCR方法获得带有Asp-Pro-Pro前缀的重组人骨形态发生蛋白-4成熟肽(recombination human bone morphogenetic protein 4 mature peptide,rhBMP-4m)编码序列并克隆入pRSET载体,转化大肠杆菌后诱导表达;经免疫印迹法鉴定融合蛋白;甲酸裂解去除6His标签后细胞学实验检测其活性.结果:构建的融合表达载体序列测定结果与预期结果一致;诱导表达的DPP-rhBMP-4m融合蛋白以包涵体形式存在,占菌体总蛋白量的37%,亲和层析后目的蛋白纯度为97%;免疫印迹法鉴定显示,该融合蛋白可与相应抗血清产生特异性反应;对C2C12细胞具有良好的生物活性.结论:成功构建了利于目的蛋白纯化的pRSET-DPP-rhBMP-4m融合表达载体.; 王丽陈苏民陈南春张晓楠赵玮钦黄勇王涛关路媛; 关键词：纯化

黄勇

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