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PKCα抑制生肌素转位及nAChR基因表达被引量：6: 2001年; 烟碱样乙酰胆碱受体 (nAChR)的表达调控受神经电活动影响 ,电刺激引起肌细胞膜去极化可抑制nAChR的表达 .以往的研究表明 ,Ca2 +和PKC以及生肌素在其中发挥着重要的作用 .然而 ,目前尚不清楚究竟是哪种PKC亚型参与此过程 ,PKC激活对特异转录因子生肌素浆核转位有何影响 ?为探讨PKC在去极化 nAChR转录偶联中的作用 ,构建了含nAChRγ亚基启动子的绿色荧光蛋白 (GFP)表达载体pEGFP γ ,将其分别与 4种cPKC(PKCα、PKCβⅠ、PKCβⅡ、PKCγ)真核表达载体共转染C2C12肌细胞 .结果发现PKCβⅠ、PKCβⅡ对nAChRγ启动子驱动的GFP报告基因表达没有影响 (P >0 .0 5 ) ,PKCγ对报告基因表达有抑制作用 (P <0 .0 5 ) ,PKCα则有明显抑制作用 (P <0 .0 1) .采用 4种cPKC真核表达载体与GFP 生肌素融合蛋白表达载体 (pGFP myog)共转染C2C12肌细胞 ,观察了不同亚型PKC表达对生肌素浆至核转位的影响 ,发现只有强制性表达外源性PKCα可明显抑制生肌素向核中转位 ,而PKCβⅠ、PKCβⅡ及PKCγ对生肌素浆核转位没有明显抑制作用 .结果提示 ,PKCα通过抑制生肌素转位是阻遏nAChR基因表达机制之一 .; 陆纲宫明陈瑞华贾弘禔; 关键词：蛋白激酶C

去极化时Ca^(2+) 内流引起蛋白激酶C_α浆膜转位被引量：2: 2001年; 为观察胞外Ca2 + 内流和肌浆网Ca2 + 释放两种来源的Ca2 + 对cPKCα转位激活的影响 ,揭示PKC在去极化 nAChR转录偶联中的作用 ,构建了pPKCα EGFP N1融合蛋白真核基因表达载体 .转染C2C1 2肌细胞后 ,采用激光共聚焦显微镜记录了KC1或咖啡因处理所引起的细胞Ca2 + 波变化及PKCα GFP融合蛋白在细胞内的分布 .结果提示 ,只有用KC1处理引起细胞膜去极化时 ,伴随Ca2 +内流 ,才能观察到PKCα GFP绿色荧光在细胞内发生的细胞浆至细胞膜分布变化 .然而 ,采用肌浆网Ca2 + 通道激动剂咖啡因刺激肌细胞 ,使肌浆网中Ca2 + 释放 ,未见PKCα GFP绿色荧光在浆、膜分布发生任何变化 .结果提示 ,去极化时外Ca2 + 内流可引起PKCα转位激活 ,肌浆网Ca2 + 释放对PKCα的转位激活没有影响 .; 陆纲陈瑞华宫明邵世滨贾弘禔; 关键词：去极化 CA^2+内流 PKC 转位

电刺激引发骨骼肌细胞钙振荡对nAChRγ启动子活性的影响被引量：5: 2003年; 利用不同电刺激条件模拟神经电活动 ,研究C2C12细胞 (小鼠骨骼肌成肌细胞系 )内Ca2 + 激活的不同形式及其对nAChR基因表达活性的影响 .电刺激分化 1d的C2C12细胞 ,用共聚焦显微镜记录不同电刺激参数引起的细胞内Ca2 + 信号变化 ,共观察到 3种不同形式的Ca2 + 信号 ,称之为整体Ca2 + 振荡、局部Ca2 + 振荡和局部Ca2 + 振荡诱发的整体Ca2 + 振荡 .在此基础上 ,又构建nAChRγ亚基启动子萤光素酶报告基因质粒并转染C2C12细胞 ,进一步检测不同形式Ca2 + 引起细胞萤光素酶活性的变化 ,测定细胞内PKC活性的改变 .不同Ca2 + 振荡引起细胞内PKC活性升高幅度不同 ;电刺激C2C12细胞可导致nAChRγ基因表达活性降低 ,3种Ca2 + 振荡对nAChRγ基因启动子活性的影响无显著差异 .结果表明 ,电刺激可引起肌细胞产生不同形式Ca2 + 信号 ,但不同形式Ca2 + 信号对nAChRγ启动子活性的抑制无明显差异 ,提示Ca2 +; 王子梅钱锋陆纲孙佳贾弘禔倪菊华; 关键词：电刺激骨骼肌细胞钙振荡信息传递

蛋白激酶Cα-EGFP及其突变体真核表达载体的构建和在C2C12细胞中的表达被引量：2: 2001年; 目的:研究PKCα结构与转位的关系。方法:用PCR的方法构建了4个PKCα突变体,在DNA连接酶的作用下与pEGFP-N1结合后转移至质粒中,构建PKCα突变体-EGFP真核表达载体。观察它们在C2C12细胞中的表达及转位情况。结果:pPKCα-EGFP-N1转染C2C12肌细胞24h后,细胞内表达的PKCα-GFP融合蛋白主要定位于细胞浆,细胞核中未见分布。pPKCα-βⅠ-EGFP-N1、pPKCβⅠ-α-EGFP转染C2C12细胞24h的表达产物集中在胞浆。pPKCα(-)-EGFP-N1、pPKCα(m)-EGFP-N1转染C2C12细胞24h的定位与野生型明显不同。结论:PKCα的调节区(C1V1C2)尤其是RACK结合区(C2)、PKCα的催化区(C3V4C4)尤其是ATP结合位点与PKCα的转位密切相关。; 陈瑞华张耕陆纲鹿培源贾弘禔; 关键词：PKC EGFP C2C12细胞胞浆蛋白激酶CΑ 突变体

鸡转录增强因子-1相关基因cDNA片段的克隆及其在发育过程中的表达: 2001年; 目的 :克隆转录增强因子 1(transcriptionenhancerfactor 1,TEF 1)相关基因 (relatedTEF 1,RTEF 1) ,检测鸡发育过程RTEF 1基因的表达及组织分布。方法 :从 13d鸡胚骨骼肌mRNAs经RT PCR方法扩增RTEF 1的编码序列 (cDNA) ,将其克隆到 pGEM和 pUC载体并进行核苷酸序列分析。采用RT PCR技术检测鸡胚发育第9天至雏鸡孵出后 6周的骨骼肌组织中RTEF 1基因的表达 ,并测试其在 13d鸡胚和出生后 1d雏鸡的骨骼肌、心肌、脑、肝和胗等 5种组织中的存在。结果 :克隆序列分析结合GenBank检索表明 ,所克隆的cDNA片段 ( 90 0bp)与cTEF 1A序列仅相差两个碱基。应用RT PCR技术在鸡胚发育 9d至出生后 6周雏鸡的骨骼肌组织均检出了RTEF 1基因的表达 ;13d鸡胚和出生后 1d雏鸡的骨骼肌、心肌、脑、肝和胗等 5种组织中均有TEF 1相关基因的转录。结论 :克隆的cDNA片段属多种组织普遍存在的cTEF 1A。与先前检测的M CAT结合因子发生规律 (在两周前表达 )不同 ,cTEF 1A在鸡胚发育的第 9天至出生后; 张雪平张洁欣陆纲陈瑞华贾弘褆; 关键词：基因表达鸡胚发育

“混合克隆”快速筛选重组体: 2002年; 目的 :从DNA重组体中快速鉴定出阳性克隆。方法 :通过将单克隆菌液混合分组提取质粒酶切鉴定找出阳性组 ,再从阳性组中鉴定出阳性单克隆。结果 :1 4组混合克隆中 2组为阳性 ,在 2个阳性组 8个单克隆中鉴定出 2个阳性单克隆。结论 :采用混合克隆方法筛选重组体可大大缩短筛选时间 ,而且没有假阴性 ,是一种既快又可靠的方法。目的 :从DNA重组体中快速鉴定出阳性克隆。方法 :通过将单克隆菌液混合分组提取质粒酶切鉴定找出阳性组 ,再从阳性组中鉴定出阳性单克隆。结果 :1 4组混合克隆中 2组为阳性 ,在 2个阳性组 8个单克隆中鉴定出 2个阳性单克隆。结论 :采用混合克隆方法筛选重组体可大大缩短筛选时间 ,而且没有假阴性 ,是一种既快又可靠的方法。; 陆纲鹿培源贾弘禔; 关键词：重组DNA 克隆基因扩增分子克隆

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陆纲