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王立生: 作品数：183 被引量：635H指数：13; 供职机构：安徽医科大学更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家重点基础研究发展计划更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

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应用生物发光成像技术示踪植入的骨髓间充质干细胞被引量：3: 2009年; 以间充质干细胞(MSC)为基础的细胞治疗已进入临床试验阶段,用于多种组织修复,而移植细胞体内存活是影响疗效的重要因素。为了体内示踪MSC,构建了萤火虫荧光素酶基因(fluc)逆转录病毒表达载体pL(fluc)SN,并筛选出稳定表达fluc的GPE+86细胞克隆。将逆转录病毒上清转染C57小鼠来源的MSC,经G418筛选后得到稳定表达fluc的MSC。将2×106个标记好的细胞注射正常骨骼肌,应用生物发光技术检测移植后不同时间细胞的存活情况。结果表明,随着时间的延长,细胞存活数目逐渐减少;移植后1天细胞死亡率高达(43.2±11.7)%,3天后细胞存活(8.6±2.5)%,6天后仅为(5.4±3.1)%,10天时未检测到荧光信号。结论:生物发光成像技术可用于移植的MSC体内示踪,但是即使将MSC植入正常的骨骼肌组织,大部分注入的MSC也将在短期内死亡。; 边素艳盖鲁粤叶平杨月峰王华郭子宽王立生; 关键词：骨髓间充质干细胞细胞标记细胞移植

造血干细胞作为靶细胞的基因治疗研究被引量：2: 1997年; 造血干细胞是基因治疗的理想靶细胞,在遗传病、恶性肿瘤、严重免疫缺陷及感染性疾病的治疗中具有广阔的应用前景。造血细胞纯化、造血生长因子应用、造血细胞体外扩增及基因转移技术的研究进展为造血细胞的基因转移及基因治疗提供了实验基础。目前,造血细胞基因治疗涉及的基因包括遗传病相关基因、耐药基因、核酶等。本文主要就造血细胞基因治疗的应用及存在的问题作一概述。; 高文谦王立生; 关键词：造血干细胞基因转移基因治疗

肝细胞生长因子基因修饰骨髓间质干细胞在心肌缺血治疗中的应用: 用携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒转染骨髓间质干细胞，获得高表达肝细胞生长因子的干细胞，局部注射治疗心肌缺血，既可以改善局部缺血症状、降低胶原沉积，又可以修复部分坏死的心肌细胞，具有明显的治疗效果。; 段海峰王立生吴祖泽吴丹莉刘红军张群伟王华鲁茁壮贾向旭哈小琴; 文献传递

Aurora激酶抑制剂VX-680对慢性髓系白血病细胞增殖及凋亡的影响被引量：1: 2014年; 本研究探讨Aurora激酶抑制剂VX-680在体外对白血病细胞系K562、KCL22和慢性髓系白血病(CML)患者骨髓CD34+细胞的增殖和凋亡的影响。利用CCK-8法观察VX-680对K562和KCL22细胞的增殖作用,细胞计数方法测定VX-680对CML的CD34+细胞增殖影响,Annexin V-PI凋亡检测试剂盒、流式细胞术分析VX-680对K562、KCL22细胞凋亡效应,集落形成试验检测VX-680对CML及正常供者(donor)的骨髓CD34+细胞集落形成能力影响。结果表明,Aurora激酶抑制剂VX-680(20-100 nmol/L)在处理细胞第3天时能明显抑制K562和KCL22细胞增殖(P<0.01),并能抑制CML患者骨髓CD34+细胞增殖,而且随着剂量增加,抑制作用增强;VX-680(20nmol/L)作用K562和KCL22细胞3天时可诱导细胞凋亡(P<0.01);集落形成试验表明,CML患者骨髓CD34+细胞在VX-680的体外处理下集落形成能力较正常骨髓CD34+细胞明显下降(P<0.01)。结论:Aurora激酶抑制剂VX-680在体外对慢性髓系白血病细胞有抑制增殖和促进凋亡的作用。; 尹玥孙慧燕李晓林肖凤君王立生; 关键词：AURORA激酶慢性髓系白血病

脑红蛋白重组腺病毒表达载体的构建与鉴定: 2006年; 目的:为进一步研究脑红蛋白(NGB)的生理功能并为基因治疗缺血性脑损伤提供有效的表达载体,应用细菌内同源重组方法分别构建含NGB及绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒表达载体,并对其进行鉴定。方法:用电转方法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入B J5183细菌,制备B J5183-pAdEasy-1细菌,再以后者作为电感受态细菌,与线性化质粒pShuttle-CMV-NGB进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAdEasy-NGB,转染293细胞,制备含脑红蛋白基因的重组腺病毒。结果:通过PCR、序列测定和W estern印迹杂交鉴定,确认该重组腺病毒表达载体可正确表达脑红蛋白。结论:成功地构建了表达NGB基因的重组腺病毒载体,为深入开展脑红蛋白的功能研究以及用于缺血性脑损伤疾病的基因治疗奠定了基础。; 刘铖高艳秦树桐文圣梅王立生张成岗; 关键词：神经系统疾病脑红蛋白腺病毒科腺病毒载体基因表达基因疗法

Hsa-miR-486-5p的肿瘤及细胞骨架相关靶基因的预测分析被引量：1: 2014年; microRNAs的功能研究离不开其靶基因的预测。本文利用TargetScan预测软件预测分析hsa-miR-486-5p的肿瘤及细胞骨架相关靶基因。通过分析这些靶基因在肿瘤中的主要功能,为hsa-miR-486-5p的功能研究奠定基础,同时对其他microRNAs的功能研究提供有力的参考。; 孙慧燕杨晓明王立生; 关键词：MICRORNA 靶基因肿瘤

携带免疫基因的前列腺癌特异性溶瘤腺病毒制备及功能验证: 2014年; 目的制备前列腺癌特异性免疫溶瘤双功能腺病毒Ad-PL-PPT-E1A,评价其体外溶瘤和免疫激活功能。方法以LNCaP细胞和Jurkat细胞的cDNA为模板,采用普通PCR和巢式PCR分别扩增获得前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)基因、CD40L-N基因和CD40L-C基因;并采用重叠PCR方法将PSA、Linker、CD40L-N和CD40L-C基因依次连接并扩增获得融合蛋白基因PSA-IZ-CD40L(PL)。采用以Adeasy系统为基础的溶瘤腺病毒构建体系,构建并制备携带PL的溶瘤重组腺病毒Ad-PL-PPT-E1A。以不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)的溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A感染PC3M细胞后不同时间点,流式细胞术检测细胞凋亡情况;50 MOI的Ad-PL-PPTE1A感染PC3M细胞,于48 h收集其裂解液,并将其作用于正常人外周血单个核细胞,CCK8检测细胞增殖能力。结果 PCR成功扩增并连接获得融合蛋白基因PL,构建并制备了携带PL基因的溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A。RTPCR和Western印迹检测结果显示,Ad-PL-PPT-E1A可在PC3M细胞中高效表达E1A和PL蛋白。将Ad-PL-PPTE1A感染PC3M细胞后,可见明显的细胞病变;同时,流式细胞检测结果显示,当感染滴度达到200 MOI时,48 h的凋亡率达到70.67%±2.98%。CCK8结果显示,Ad-PL-PPT-E1A感染后,可恢复PC3M细胞裂解液对人外周血单个核细胞的抑制作用。结论成功制备和鉴定了前列腺癌特异性免疫溶瘤双功能腺病毒Ad-PL-PPT-E1A,并在体外证实了其具有溶瘤和免疫的双重功能。; 薛淑雅杨月峰王华肖凤君孙慧燕张群伟王秀冬王立生; 关键词：前列腺癌溶瘤腺病毒免疫基因

腺病毒-甲病毒杂合载体的构建: 2010年; 目的将腺病毒Ad5/F11p造血细胞靶向和甲病毒复制子载体目的基因高效转录的特点相结合,构建腺病毒-甲病毒杂合载体,以提高目的基因在造血细胞的表达水平。方法基本实验过程包括骨架质粒构建,穿梭质粒构建,同源重组产生杂合病毒基因组,杂合病毒在包装细胞的拯救和扩增,以及杂合病毒对造血细胞基因转移效率的初步评价。具体步骤如下:利用重叠延伸PCR技术将pFiber5/11p质粒上Ad5的E4区部分删除产生骨架质粒pAdEasy/F11pDE4orf3。在pShuttle质粒的多克隆位点处分别插入造血细胞特异性启动子(CD11a promoter,CD11Ap)、甲病毒载体元件(nsP)、目的基因(GFP)、PolyA加尾信号构建杂合穿梭质粒pSh-SFV-GFP。骨架质粒与穿梭质粒在大肠杆菌BJ5183菌株中同源重组产生杂合病毒质粒pAd5/F11p-SFV-GFP,经与辅助病毒质粒Ad5/f11p-HV共转染293细胞后拯救出杂合病毒Ad5/F11p-SFV-GFP,经CsCl密度梯度离心法纯化,得到的病毒滴度为3×1010pfu/ml。与对照病毒Ad5-GFP相同感染复数(100MOI)分别感染U937细胞,利用流式细胞术检测GFP+细胞比例。结果pAdEasy-1/F11p-E4orf3和pSh-SFV-GFP经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致;CsCl密度梯度离心纯化得到杂合病毒;100MOI Ad5/F11p-SFV-GFP感染U937细胞2 d后,GFP+细胞比例为55.79%,而对照病毒Ad5-GFP的感染效率为2.42%。结论成功构建了腺病毒-甲病毒杂合载体,为进一步评价其对造血细胞的基因转移效率奠定了基础。; 李泽良王华杨月峰肖凤君鲁茁壮王立生; 关键词：腺病毒科甲病毒属复制子基因转移技术

Ad-HGF基因修饰的胎盘间充质干细胞治疗兔肢体缺血的实验研究被引量：1: 2016年; 目的研究重组腺病毒介导肝细胞生长因子(adenoviral vector mediated human hepatocyte growth factor,AdHGF)修饰的胎盘源间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSC)在兔肢体缺血模型中促新生血管生成的作用。方法无菌取足月产妇胎盘胎儿面中心区域胎盘组织,胶原酶消化法分离干细胞,体外培养传代,感染Ad-HGF 48 h后收集细胞用于治疗兔肢体缺血实验。左侧治疗组后肢缺血肌肉组织内多点注射总细胞数5×106/ml Ad-HGF修饰的PMSC,右侧对照组后肢缺血肌肉组织内注射生理盐水。结果治疗后第14天腹主动脉穿刺行数字减影血管造影(digital subtraction angiography,DSA)检查,可见左侧肢体缺血治疗后微血管生成数明显多于未治疗右侧肢体,血管形成能力明显增强。苏木精伊红染色法(HE)后置光镜下观察显示,治疗组毛细血管密度明显大于未治疗组(P<0.05)。实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,q PCR)检测后肢肌肉组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)、HGF的表达明显升高(P<0.05)。结论经Ad-HGF基因修饰的PMSC能明显促进血管新生,加快局部缺血组织血流循环的重建,是治疗肢体慢性缺血的有效手段。; 肖凤君黄晓东王少霞王华杨月峰李沛雨王立生; 关键词：间充质干细胞 AD-HGF 肢体缺血成纤维细胞生长因子肝细胞生长因子

1-磷酸鞘氨醇对淋巴管内皮细胞生物学特性调节作用的研究: 2009年; 目的:研究1-磷酸鞘氨醇(S1P)对淋巴管内皮细胞(HDLEC)的生物学特性的调节作用及其调节机制。方法:应用RT-PCR方法检测HDLEC是否表达SPK及S1P受体,应用MTT法、细胞扩散盒技术检测S1P对HDLEC增殖、迁移特性的影响,并用Western印迹方法检测S1P对HDLEC的MAPK信号通路的调节。结果:HDLEC表达SPK及S1P受体,包括S1P1,S1P2,S1P3和S1P4。外源性S1P对HDLEC没有促增殖作用,但可促进其迁移,并可通过S1P1和S1P2诱导MAPK快速磷酸化。结论:初步研究结果提示,S1P可以影响淋巴管内皮细胞的生物学特性,有可能成为调控淋巴管生成及其功能的新靶点。; 肖秀斌王华李庆芳严俊杨月峰徐尹张伟京王立生; 关键词：1-磷酸鞘氨醇淋巴管内皮细胞细胞增殖迁移

王立生

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