孟凡静
- 作品数：23 被引量：25H指数：3
- 供职机构：徐州医学院附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省“六大人才高峰”高层次人才项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学环境科学与工程更多>>
- AATF-Che1超家族基因原核表达及其融合蛋白纯化
- 2014年
- 目的 体外构建抗凋亡转录因子（AATF）-Che1重组蛋白原核表达载体pGEx-4T-1-AATF-Che1,优化pGEX-4T-1-AATF-Che1重组载体原核诱导表达条件,并获得可溶性的纯化谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白.方法 采用聚合酶链反应（PCR）法从pGEX-4T-1-AATF重组质粒扩增出AATF-Che1基因,将其与原核表达载体pGEX-4T-1双酶切后,回收目的基因片段.通过T4连接酶定向连接AATF-Che1基因和线性化原核表达载体pGEX-4T-1,获得重组蛋白AATF-Che1原核表达质粒pGEX-4T-1-AATF-Che1.将构建正确的表达质粒转化入大肠埃希菌感受态细胞BL21,并采用诱导剂异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白AATF-Che1的表达.考察不同诱导剂IPTG浓度、诱导时间和诱导温度对重组蛋白表达量及表达方式的影响,从而对诱导条件进行优化.采用谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠对可溶形式的GST融合蛋白进行纯化,并采用Western蛋白免疫印记（WB）法鉴定获得的纯化蛋白.结果 原核表达质粒pGEX-4T-1-AATF-Che1的酶切、PCR鉴定结果及测序结果均正确;IPTG诱导蛋白在约65 kD处出现了1条新的蛋白条带,即AATF-Che1与GST的融合蛋白.不同的诱导时间及不同的IPTG浓度条件下,诱导融合蛋白的量均未见明显变化;37℃诱导时,重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,而16℃诱导时,融合蛋白可溶性地存在于上清液中.最终成功获得AATF-Che1可溶性纯化的融合蛋白,且WB法鉴定其抗原性良好.结论 体外成功构建AATF-Che1基因重组蛋白原核表达载体pGEX-4T-1-AATF-Che1,寻找到优化的重组载体原核诱导表达条件,并获得了大量可溶形式纯化的GST融合蛋白,为进一步研究AATF-Che1超家族基因在肿瘤中的作用奠定了基础.
- 周俊曹江孟凡静冯浩潘秀英吴庆运陈翀牛铭山徐开林
- 关键词：原核表达
- 26S蛋白酶抑制剂b-AP15对Jurkat及RS4;11细胞增殖、凋亡的影响及凋亡机制的研究
- 2015年
- 目的 探讨26S蛋白酶抑制剂b-AP15对Jurkat细胞与RS4;11细胞增殖及细胞凋亡的影响,并分析其作用机制.方法 无菌条件下对Jurkat细胞与RS4;11细胞进行培养,根据有无b-AP15处理,将其分为4组：①Jurkat细胞实验组;②Jurkat细胞对照组;③RS4;11细胞实验组;④RS4;11细胞对照组.其中,Jurkat细胞实验组与RS4;11细胞实验组采用浓度分别为0.05,0.10,0.50,1.00,5.00 μmol/L b-AP15处理24,48 h;Jurkat细胞对照组与RS4;11细胞对照组采用RPMI 1640培养基进行同步培养.采用CCK-8法绘制4组细胞增殖曲线;采用Annexin Ⅴ-别藻蓝蛋白（APC）/7-氨基放线菌素D（7-AAD）双标记流式细胞术检查4组细胞凋亡情况;采用流式细胞术检测细胞4组细胞周期分布情况;采用实时定量PCR检测4组细胞B细胞淋巴瘤/白血病-2相关Ⅹ蛋白（Bax）基因、B细胞淋巴瘤/白血病（Bcl）-2基因、Ⅹ连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）、周期素依赖性激酶（CDK）1基因及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3基因mRNA表达水平.结果 ①b-AP15对Jurkat细胞与RS4;11细胞增殖均具有抑制作用,且该抑制效应呈时间与剂量依赖性;Jurkat细胞经b-AP15处理24,48 h后,半数抑制浓度（IC50）分别为（1.52±0.35）μmol/L与（0.54±0.01） μmol/L,RS4;11细胞经b-AP15处理24,48 h后IC50分别为（0.97±0.02）μmol/L与（0.08±0.03）μmol/L.②使用浓度为1.5 μmol/L b-AP15处理Jurkat细胞实验组后,其与Jurkat细胞对照组相比细胞凋亡率显著增高,且差异有统计学意义（P＜0.001）;使用浓度为1.0 μmol/Lb AP15处理RS4;11细胞实验组后,其与RS4;11细胞对照组相比细胞凋亡率亦显著增加,且差异亦有统计学意义（P＜0.001）;且Jurkat细胞与RS4;11细胞经b-AP15处理48 h后,与处理24 h后者相比细胞凋亡率增高,且差异均有统计学意义（t=11.887,7.449;P＜0.001）.③与Jurkat细胞对照组相比,使用浓度为1.5 μmol/L b-AP15处理Jurkat细胞实验组24 h后,Jurkat细胞周
- 周俊曹江孟凡静冯浩徐开林
- 关键词：蛋白酶抑制药细胞周期JURKAT细胞RS4
- AMPK激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸对U937细胞增殖、分化和凋亡的影响被引量：3
- 2013年
- 目的探讨单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸（AICAR）对急性单核细胞白血病细胞系U937细胞增殖、分化和凋亡的影响，并分析其可能的作用机制。方法用不同浓度AICAR处理U937细胞24、48h，用CCK-8法绘制细胞增殖曲线；以细胞形态学、AnnexinV／7-氨基放线菌素D（7-AAD）双标记等分析细胞凋亡情况；用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CDllb表达。用实时定量PCR检测Bcl—xL、Bax、Bim、caspase-3mRNA表达的变化。结果AICAR对U937细胞增殖具有显著抑制作用，且作用呈时间和剂量依赖性，24、48h的半数抑制浓度（IC50）值分别为1．1和0．9mmoL／L。1．0mmol／LAICAR作用U937细胞24h，流式细胞术检测结果显示CDllb阳性细胞率无明显变化（P〉0．05），但细胞形态学出现典型的凋亡特征；AnnexinV／7-AAD标记的阳性细胞升高，细胞凋亡率为（6．81±1．16）％，高于对照组的（2．744-0．32）％（P〈0．05）。1．0mmol／LAICAR诱导U937细胞凋亡过程中Bcl—xL、Bax表达无明显变化，Bim、caspase-3表达显著增加（P〈0．05）。结论AICAR能有效抑制U937细胞增殖及促进细胞凋亡，但对U937细胞向髓系分化无明显影响，其促凋亡机制与上调Bim与caspase-3基因表达有关。
- 吕超曹江孟凡静曾令宇陈翀吴庆运徐开林
- 关键词：U937细胞
- 输注鼠基因工程Treg细胞对小鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的作用研究
- 目的：探讨输注慢病毒载体介导的鼠基因工程调节性T淋巴细胞(Treg细胞)对小鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病(GVHD)的影响。方法：建立小鼠异基因骨髓移植模型,在移植时联合输注基因工程Treg,通过受鼠移植后生存期、G...
- 孟凡静曹江曾令宇李振宇徐开林
- 关键词：慢病毒载体调节性T淋巴细胞异基因骨髓移植移植物抗宿主病
- NANOG基因表达下调对急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡的影响
- 2013年
- 目的探讨NANOG基因在人急性T淋巴细胞白血病（WALL）细胞株中的表达及下调该基因表达对细胞凋亡的影响及可能机制。方法利用RT-PCR及Westernblot方法检测T-ALL细胞系MOLT-4、CCRF—HSB2、Jurkat细胞NANOG基因表达情况。通过构建携带NANOG特异性shRNA的慢病毒载体包装病毒颗粒，感染MOLT-4细胞后经分选获得稳定表达株，并在基因及蛋白水平检测NANOG干扰效率。用流式细胞术检测各组细胞早期凋亡（Annexin VV7-AAD-）及晚期凋亡（Annexin V＋/7-AAD＋）率，并利用实时定量PCR技术检测凋亡相关基因的表达情况。结果MOLT-4和CCRF—HSB2细胞NANOGmRNA及蛋白表达阳性。构建慢病毒干扰质粒pLB．shNANOG-1、pLB—shNANOG-2及pLB．shRNA对照，包装病毒颗粒超速离心后病毒滴度达（1．83～3．12）×10^8IU／ml。病毒感染MOLT-4细胞后经实时定量PCR及Wesmmblot方法证实两种shRNA可有效下调NANOGmRNA及蛋白的表达。流式细胞术检测显示shNANOG．1及shNANOG。2组细胞早期凋亡率分别为（8．06±1．61）％及（5．67±1．59）％，较MOLT-4组[（1．13±0．40）％]及对照shRNA组[（1．15±0．49）％]明显升高（P〈0．05）。而各组细胞晚期凋亡率无明显变化（P〉0．05）。实时定量PCR法证实shNANOG-1及shNANOG．2转染的细胞中TP53、PMAIPl、CASP9等基因表达较未转染组及转染非特异shRNA组显著升高（P〈0．05），而Bcl-2基因表达则明显下降（P〈0．05）。结论NANOG在多种人T-ALL细胞系中表达，下调NANOG的表达可引发T_ALL细胞凋亡。
- 曹江李莉吕超孟凡静周俊陈翀曾令宇李振宇徐开林
- 关键词：基因NANOG白血病淋巴样细胞凋亡
- H132.携带鼠Foxp3基因的自身失活型慢病毒载体的构建及表达
- 孟凡静曹江曾令宇李振宇潘秀英徐开林
- 文献传递
- NANOG基因在急性淋巴细胞白血病细胞的表达及其慢病毒干扰载体的构建被引量：1
- 2014年
- 本研究探讨NANOG基因在人急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞中的表达并构建特异性干扰NANOG表达的慢病毒载体。利用RT-PCR及Western blot技术检测MOLT-4、CCRF-HSB2、Jurkat等ALL细胞系及在我院住院治疗的15例新诊断的ALL患者骨髓细胞中NANOG的表达情况。通过构建携带NANOG特异性shRNA的慢病毒载体包装病毒颗粒,感染MOLT-4细胞后经分选获得稳定表达株,并在基因及蛋白水平检测NANOG干扰效率。结果表明,MOLT-4细胞、CCRF-HSB2细胞以及33.3%的ALL患者中可见NANOG基因mRNA的扩增产物及蛋白表达。测序表明,ALL患者及MOLT-4、CCRF-HSB2细胞主要表达NANOGP8 mRNA。构建慢病毒干扰质粒pLB-shNANOG-1、pLB-shNANOG-2及pLB-shcontrol,包装病毒颗粒超速离心后病毒滴度达(1.83-3.12)×108IU/ml。病毒感染MOLT-4细胞后经流式细胞仪分选获得GFP+细胞。实时定量PCR及Western blot证实,两种shRNA可有效下调NANOG基因及蛋白的表达。结论:MOLT-4细胞、CCRF-HSB2细胞以及部分ALL患者骨髓细胞中存在NANOG的表达,其主要为NANOGP8 mRNA的转录。成功构建了特异性干扰NANOG表达的慢病毒载体,获得可稳定下调NANOG表达的MOLT-4细胞株。
- 曹江孟凡静李莉吕超周俊程海陈伟陈翀徐开林
- 关键词：NANOG急性淋巴细胞白血病慢病毒
- Akt特异性抑制剂MK2206诱导U937及RS4;11细胞凋亡及其机制被引量：4
- 2015年
- 目的:本研究探讨Akt激酶抑制剂MK2206对U937及RS4;11细胞增殖、凋亡的影响,并分析其可能的作用机制。方法:以不同浓度MK2206处理U937及RS4;11细胞24、48 h,用CCK-8法绘制细胞增殖曲线;Annexin V/7-氨基放线菌素D(7-AAD)双标记法分析细胞凋亡情况;流式细胞术检测细胞周期的变化;实时定量PCR检测Bax、Bcl-2、XIAP、CDK1、caspase-3基因mRNA表达的变化。结果:MK2206对U937及RS4;11细胞增殖具有抑制作用,且抑制效应呈一定的时间和剂量依赖性,U937细胞24、48 h的半数抑制浓度(IC50)分别为(0.48±0.15)和(0.09±0.01)μmol/L,RS4;11细胞24、48 h的半数抑制浓度(IC50)分别为(0.91±0.02)和(0.68±0.11)μmol/L。0.5μmol/L MK2206作用于U937细胞及1.0μmol/L MK2206作用于RS4;11细胞24 h、48 h,Annexin V/7-AAD标记的阳性细胞升高,U937细胞组24 h细胞凋亡率为(4.18±0.70)%,48 h细胞凋亡率为(22.53±4.67)%,均高于对照组的(1.35±0.34)%(P<0.05),且48 h细胞凋亡率较24 h更为明显(P<0.05);RS4;11细胞组24 h和48 h细胞凋亡率分别为(5.74±0.58)%和(10.07±1.24)%,均高于对照组的(1.32±0.31)%(P<0.05),且48 h细胞凋亡率较24 h更为明显(P<0.05)。流式细胞术检测细胞周期结果显示,U937细胞组G2/M期细胞比例为(96.78±9.11)%,高于对照组的(9.64±0.91)%(P<0.05);RS4;11细胞组G2/M期细胞比例为(14.19±3.82)%,高于对照组的(5.75±1.28)%(P<0.05)。荧光定量PCR检测结果示,两种细胞中Bax、caspase-3 mRNA相对表达水平升高,而Bcl-2、XIAP表达水平降低,同时伴CDK1 mRNA水平的减少,与各自对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:MK2206能有效抑制U937及RS4;11细胞增殖及促进细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G2/M期,其促凋亡机制与上调Bax与caspase-3基因表达、下调Bcl-2与XIAP基因表达有关,细胞周期G2/M期阻滞与CDK1基因表达水平下降有关。
- 周俊曹江孟凡静冯浩徐开林
- 关键词：U937细胞RS4细胞凋亡
- 二甲双胍对急性单核细胞白血病细胞株THP-1增殖、分化和凋亡的影响被引量：3
- 2015年
- 目的:探讨二甲双胍(metformin)对体外培养的急性单核细胞白血病细胞株THP-1细胞增殖、分化和凋亡的影响,并分析其可能的作用机制。方法:用不同浓度的二甲双胍分别对THP-1细胞进行体外干预,24 h、48 h后用CCK-8法检测细胞的增殖情况;20 mmol/L二甲双胍干预24 h后用Annexin V/7-AAD双标记法分析细胞凋亡情况;流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b、CD14的变化;实时定量PCR检测BCL-XL、BAX、BIM、Caspase-3mRNA表达的变化。结果:CCK-8法检测显示二甲双胍对THP-1细胞增殖具有显著的抑制作用,且作用呈时间和剂量依赖性;20 mmol/L二甲双胍干预THP-1细胞24 h后,流式细胞术检测结果显示CD11b、CD14阳性细胞率无明显变化(P>0.05);Annexin V/7-AAD标记的流式细胞术检测显示,实验组和对照组早期凋亡细胞比例分别为(2.02±0.85)%和(4.46±1.33)%,晚期凋亡细胞比例分别为(1.43±0.83)%和(3.31±0.59)%,在实验组明显高于对照组(P<0.05);20 mmol/L二甲双胍诱导THP-1细胞过程中BCL-XL、BIM表达无明显变化,BAX、Caspase-3表达显著增加(P<0.01)。结论:二甲双胍能有效抑制THP-1细胞增殖并促进细胞凋亡,但对THP-1细胞分化无明显影响,其促进凋亡机制可能与上调BAX及Caspase-3基因有关。
- 张电安孟凡静周俊马萍宋旭光曹江
- 关键词：二甲双胍白血病THP-1细胞
- 二甲双胍对急性单核细胞白血病细胞株THP-1增殖、分化和凋亡的影响
- 目的:探讨二甲双胍(metformin)对体外培养的急性单核细胞白血病细胞株THP-1细胞增殖、分化和凋亡的影响,并分析其可能的作用机制.方法:用不同浓度的二甲双胍分别对THP-1细胞进行体外干预,24 h、48 h后以...
- 曹江孟凡静冯浩周俊徐开林
