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位点特异整合型微环DNA的构建及应用被引量：2: 2014年; 目的联合应用LR克隆酶和链霉菌噬菌体ΦC31整合酶系统,建立一种获得位点特异整合型微环DNA的方法,为该载体在转基因研究中的应用提供科学资料。方法应用分子克隆技术,在目的基因表达盒及链霉菌attB位点两端接入λattR和λattL片段,随后插入ΦC31整合酶基因表达盒,构建可获得微环DNA的亲本质粒。该亲本质粒上的λattL和λattR序列可在LR克隆酶的催化下重组生成表达ΦC31整合酶的微质粒和含有目的基因表达盒及attB位点的微环DNA。以限制性内切酶酶切、定性以及定量PCR分析其重组效率。并将未经纯化的LR重组体系转染HeLa细胞,以流式细胞技术、克隆计数、ELISA等方法检测其转染率、整合率及目的蛋白表达水平,并与传统质粒进行比较。结果 LR克隆酶可有效催化亲本质粒的重组,重组率达80%以上。重组体系中的微环DNA和微质粒无需纯化即可成功转染HeLa细胞,且其转染率、整合率以及目的蛋白表达水平均高于传统质粒。结论建立了一种高效、快速获得位点特异整合型微环DNA的方法。; 刘浏周在威马晴雯

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刘浏