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一种能够稳定表达EGFP基因和Purα基因的细胞系的构建方法: 本发明属于细胞系构建技术领域，具体涉及一种能够稳定表达EGFP基因和Purα基因的细胞系的构建方法，所述构建方法首先制备pLKO.1‐puro‐EGFP‐Purα慢病毒载体，然后将pLKO.1‐puro‐EGFP‐Pur...; 何文欣郭姗姗张冰莹石晓光柴娟李永玲崔建奇; 文献传递

一种含有EGFP基因的慢病毒载体及其构建方法: 本发明属于慢病毒载体构建技术领域，具体涉及一种含有EGFP基因的慢病毒载体及其构建方法。所述慢病毒载体包括EGFP基因序列、慢病毒载体pLKO.1‐puro的基本序列、AgeI酶切位点、Eco RI酶切位点。所述制备方法...; 柴娟李永玲郭姗姗张冰莹何文欣石晓光崔建奇; 文献传递

一种含有EGFP-Purα融合基因的慢病毒载体及其构建方法: 本发明属于载体构建技术领域，具体涉及一种含有EGFP‑Purα融合基因的慢病毒载体及其构建方法。所述慢病毒载体包括EGFP‑Purα基因序列、慢病毒载体pLKO.1‑puro的基本序列、AgeI酶切位点、Eco RI酶切...; 柴娟李永玲郭姗姗张冰莹何文欣石晓光崔建奇; 文献传递

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的SCN1A--KO模型的RNA--seq分析: 目的：本次研究主要利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在体外建立SCN1A基因稳定敲除的细胞系并采用RNA-seq分析细胞的基因表达谱的变化。通过检测mRNA水平的变化分析SCN1A与DS发病之间的关联，并希望为Dra...; 石晓光; 关键词：发病机制基因表达信使RNA

利用CRISPR/Cas9技术构建CREB基因敲除细胞系并探讨CREB对APP基因表达的调控作用被引量：4: 2017年; 环磷腺苷效应元件结合蛋白(c AMP responsive element-binding protein,CREB)是重要的核转录因子,有研究表明,在阿尔茨海默病患者中,CREB的表达降低,但CREB对于淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的作用机制尚不清楚。该研究通过设计sg RNA序列并合成相应的寡核苷酸,将其克隆到p X459质粒中,构建CREB基因敲除的CRISPR/Cas9二合一表达载体。将构建成功的载体转染到HT22细胞中,通过TA克隆测序和T7E1酶切分析来验证sg RNA的活性。将构建的载体转染到HT22细胞中,用嘌呤霉素进行药物筛选,构建稳定的CREB基因敲除的细胞系。CREB对APP基因表达的调控作用通过检测其在正常HT22细胞和CREB基因敲除的HT22细胞系中的表达情况来进行确认。结果显示,成功构建了CRISPR/Cas9技术对CREB基因进行敲除的二合一表达载体,所设计的sg RNA的插入序列和开放阅读框架完全正确,经过酶切分析和序列测定,所构建的载体与实验设计相一致。CREB基因敲除的HT22细胞系其敲除效率达到90%以上。通过Western blot分析检测CREB对APP表达的影响,结果发现,当CREB基因敲除后,APP表达增加,而过表达CREB时,则APP蛋白质表达水平下降。这提示,CREB对APP的表达有下调作用,具体的机制还将继续研究。; 郭姗姗张冰莹何文欣石晓光刘昆梅孙涛崔建奇; 关键词：CREB 基因敲除阿尔茨海默病

癫痫大鼠小胶质细胞活化与P2Y12受体的表达及Purα的影响: 2017年; 目的研究急性癫痫状态下小胶质细胞活化与P2Y12受体的表达,以及Purα对P2Y12受体表达的影响。方法用免疫组织化学方法检测大鼠急性癫痫持续状态后不同时间点海马组织中由IBA1标记的小胶质细胞的活化;用Western blot检测癫痫状态下海马组织中P2Y12受体和Purα的表达水平,以及检测Purα在癫痫状态下对P2Y12受体表达水平的影响。结果癫痫组大鼠海马组织中的小胶质细胞被激活,表现为胞体增大、数量增多、突起数量增多且长度变短。癫痫不同时间点小胶质细胞活化的程度不同,癫痫2h时,小胶质细胞活化最为明显;癫痫4h时,活化的小胶质细胞数量开始减少;癫痫8h时,小胶质细胞活化程度最低。随着癫痫状态的持续,P2Y12受体表达水平呈现先上升后下降趋势,在癫痫3h时其表达水平最高,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。癫痫持续2h时,Purα过表达组的P2Y12受体的表达水平高于对照组(P<0.05),Purα沉默组的P2Y12受体的表达水平低于对照组和正常组(P均<0.05)。结论癫痫持续状态下,小胶质细胞发生活化;P2Y12受体的表达与小胶质细胞活化状态有关;Purα能够上调P2Y12受体的表达水平。; 李平袁程敏郭凤英郭姗姗张冰莹何文欣石晓光孙涛崔建奇; 关键词：小胶质细胞

应用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠海马神经元中Purα基因可减弱神经元对DNA损伤的修复作用被引量：1: 2018年; 人转录活化因子Purα是体内重要的转录因子,在体内多个环节中都发挥着重要的作用,尤其是在神经系统中,它与神经元的发育,突触形成都有很密切的关系。该文通过构建Purα基因敲除的小鼠海马神经元细胞系来观察其在DNA损伤修复中的作用。根据目的基因靶向删除外显子的位置设计相应的sg RNA序列,合成相应的寡核苷酸后克隆在p Sp Cas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒载体相应位点上,从而构建能对Purα基因进行敲除的CRISPR/Cas9质粒,将构建好的质粒通过酶切和测序进行鉴定,将经过鉴定证实相位正确及在有sg RNA序列插入的阳性质粒转染到小鼠海马神经元(HT22)细胞中,加入嘌呤霉素进行抗性筛选,保留正常生长的细胞进行培养,从而建立能稳定地进行Purα基因敲除的细胞系。通过Real-time PCR和Western blot技术分别在转录和翻译水平上检测Purα基因的表达情况,从而来判定Purα基因的敲除效率;将所构建的Purα基因敲除的细胞用羟基脲(HU)进行处理来建立细胞DNA损伤的实验模型,通过Western blot、脉冲电场反转凝胶电泳实验及细胞毒性实验观察Purα在DNA损伤修复中的作用。实验结果证实,所插入片段相位正确。通过TA克隆测序和T7E1酶切证实所构建的质粒具有良好的CRISPR/Cas9活性,可导致基因组碱基发生突变,Real-time PCR和Western blot实验结果证实,Purα基因敲除组的Purα基因表达明显降低。Purα基因敲除后,细胞对HU引起的DNA损伤极为敏感,说明Purα在维持基因组DNA的完整性方面发挥着重要的作用,是细胞中一种不可或缺的蛋白质。该实验结果还提示,利用CRISPR/Cs9技术可以有效地对目的基因进行敲除,同时由于该质粒携带有嘌呤霉素抗性基因,利用这一特点,可以方便地建立稳定的细胞系,该细胞系可用作研究Purα基因在神经元中的生物学功能的细胞模型。; 张冰莹郭姗姗石晓光何文欣刘昆梅孙涛崔建奇; 关键词：羟基脲细胞损伤修复

含Egr-1基因启动子的报告质粒的构建及Purα对Egr-1基因表达的调控被引量：2: 2017年; 目的探讨人转录活化因子阿尔法又称富含嘌呤成份(或元件)结合蛋白(human transcriptional activator alpha,also named as purine-rich element binding protein alpha,Purα)对早期生长反应蛋白-1(Egr-1)基因表达的调控作用。方法利用PCR技术从U87MG细胞基因组DNA中扩增Egr-1基因启动子近5’端约700bp的DNA片段,将扩增的DNA片段克隆到萤火虫荧光素酶报告基因载体p GL3-Basic的相应酶切位点,构建成含有Egr-1启动子的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL3-Basic-Egr-1)并通过酶切和测序进行鉴定。通过萤火虫荧光素酶实验对p GL3-Basic-Egr-1启动子的活性进行测定并检测Purα蛋白对p GL3-Basic-Egr-1启动子活性的作用。通过q PCR和Western blot实验检测Purα蛋白在转录和翻译水平对Egr-1基因表达的调控作用。结果通过序列测定和酶切分析证实所构建的含Egr-1基因启动子的报告载体与实验设计完全一致,萤火虫荧光素酶分析实验证实所构建的p GL3-Basic-Egr-1启动子序列正确并具有活性,Purα蛋白可以抑制p GL3-Basic-Egr-1启动子的活性,过表达Purα可以在转录和翻译水平下调Egr-1基因的表达。结论 Purα蛋白具有下调Egr-1基因表达的作用。; 袁程敏柴娟李平张冰莹郭姗姗何文欣石晓光孙涛崔建奇; 关键词：基因表达调控阿尔茨海默病

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的SCN1A-K0模型的RNA-seq分析: 目的本次研究主要利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在体外建立SCN1A基因稳定敲除的细胞系并采用RNA-seq分析细胞的基因表达谱的变化。通过检测mRNA水平的变化分析SCN1A与DS发病之间的关联,并希望为Drav...; 石晓光; 关键词：SCN1A DRAVET综合征; 文献传递

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