目的:筛选参与APOBEC3B羧基端脱氨酶及抗乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)活性的重要区域和关键位点。方法:定点突变构建羧基端活性中心附近的3个螺旋区段(α2、α3、α4)的缺失突变体和α4螺旋区内(D316、K320、E321、R327、D328)位点的突变体;Southern blot筛选APOBEC3B抑制HBV复制的重要区段和关键位点;不同DNA变性PCR(differential DNA denaturation PCR,3D-PCR)和克隆测序进行验证。结果:APOBEC3B羧基端脱氨酶活性中心周围的α3和α4螺旋区缺失后,其抗病毒活性消失;D316位点突变后APOBEC3B的脱氨酶活性和抗病毒活性消失。结论:APOBEC3B羧基端的D316位点是APOBEC3B脱氨酶和抗病毒的关键位点。
目的研究宿主限制性因子莫罗尼白血病病毒10蛋白(Moloney leukemia virus 10,MOV10)对乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的调控作用。方法首先在肝癌细胞Huh7中转染HBV复制质粒,探讨HBV复制和MOV10表达的相关性;接着在Huh7中通过siRNA干扰或过表达MOV10,提取病毒核心颗粒的DNA,通过荧光定量PCR分析病毒复制水平的变化;进一步构建MOV10保守结构域Ⅱ的酶活突变体(D645A、E646Q和G648A),检测突变后对MOV10抗病毒作用的影响;在人肾上皮细胞293细胞中共转染HBV复制质粒和MOV10表达质粒,通过RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)研究MOV10与HBVRNA的结合。结果肝癌细胞Huh7转染HBV复制质粒后,MOV10蛋白水平增高;肝癌细胞Huh7中干扰内源性MOV10后,HBV复制水平升高1.5倍,而Huh7细胞中过表达MOV10,显著抑制了HBV的复制;MOV10结构域Ⅱ突变体同样显著抑制HBV的复制;MOV10可以与HBV3.5kbRNA结合。结论在肝癌细胞中,宿主限制性因子MOV10的表达与HBV复制相关,其抑制HBV复制的作用不依赖于其解旋酶活性,可能与HBV3.5kbRNA结合有关。
