刘永
- 作品数：4 被引量：4H指数：1
- 供职机构：江苏大学生命科学研究院更多>>
- 发文基金：江苏省自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- GP64表面展示元件与组Ⅱ HaSNPV出芽病毒的融合被引量：1
- 2012年
- 利用杆状病毒组ⅠAcMNPV(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus)GP64信号肽(GP64SP),C-末端跨膜区(GP64CTD)及报告基因绿色荧光蛋白(eGFP)构成的表面展示系统(gp64sp-egfp-gp64ctd),同源重组到组ⅡHaSNPV的多角体基因位置,筛选重组病毒。通过激光共聚焦观察,HaSNPV重组病毒感染Hz-AM1细胞后绿色荧光分布在质膜,表明GP64SP可以引导表达产物趋向于细胞膜。病毒感染后,收集并纯化重组的出芽病毒(BV),经Western blot检测,eGFP存在于重组病毒BV中。结果表明,组ⅠGP64表面展示系统中的重要元件GP64SP和GP64CTD能够装配到组ⅡHaSNPV BV上,可以用于组ⅡNPV表面展示目的蛋白。
- 刘永于峰曹青徐琳琳陈修文王文兵
- 关键词：GP64HASNPV
- 山羊痘病毒p32基因的原核表达及生物信息分析被引量：1
- 2012年
- 目的:构建表达山羊痘(GPV)P32蛋白的原核表达载体PTYB11-gpvp32,初步分析其在大肠杆菌(E.coli)BL21中的较佳表达条件。方法:首先用序列分析软件Blastp、MEGA5.1、SOSUI等对GPVP32进行生物信息学分析;Primer Primier5.0软件设计引物,在上游引物添加限制性酶切位点SpeⅠ、下游引物添加限制性酶切位点XhoⅠ,以pSK-gpvp32为模板,PCR扩增方法获得基因片段,克隆入PMD18-Simple-T,构建PMD18SimpleT-gpvp32载体,转化大肠杆菌(E.coli)Top10感受态细胞,经酶切筛选、测序确定插入序列的正确,然后将gpvp32克隆入原核表达载体PTYB11中的SpeⅠ、XhoⅠ酶切位点,构建原核表达质粒PTYB11-gpvp32;转化大肠杆菌(E.coli)BL21后,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白在不同诱导时间下的表达情况。结果:成功构建山羊痘病毒原核表达载体PTYB11-gpvp32并在大肠杆菌(E.coli)BL21中成功表达GPVP32,经检测重组蛋白表达量约为菌体总蛋白的28%,进化树结果表明山羊痘的亲缘关系与地理位置存在差异及在不同的羊群中进化的结果,经SOSUI等软件综合分析知GPVP32是山羊痘病毒跨膜蛋白的囊膜蛋白但不是信号肽。结论:山羊痘病毒p32基因在大肠杆菌中获得高效表达,为山羊痘病毒的流行性调查、分子生物学研究以及以后有效防治本病提供了物质基础。
- 蒲德治龚晨燕刘永蒋高建于峰
- 关键词：山羊痘病毒P32基因原核表达
- 杆状病毒GP64表面展示元件与L-天冬酰胺酶Ⅱ融合表达的初步试验被引量：1
- 2015年
- GP64是Ⅰ型杆状病毒的主要囊膜糖蛋白,利用基因重组技术在gp64中插入外源蛋白基因,二者在病毒表面融合表达活性肽或蛋白质,可以免去纯化表达产物的繁琐。L-天冬酰胺酶Ⅱ(ASP)是一种临床上广泛使用的蛋白类抗肿瘤药物,利用家蚕杆状病毒(BmNPV)GP64展示系统表面展示ASP,探讨以表面展示有ASP蛋白的出芽型病毒粒子(BV)生产抗肿瘤药物的可行性。构建重组转移载体pFast Bacdual-gp64sp-asp-gp64ctd,并转化E.coli DH10BacTM,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒DNA,将重组杆粒DNA通过脂质体转染至Bm N细胞,获得了重组病毒。重组病毒大量感染Bm N细胞后72 h,收集感染病毒的细胞培养液超速离心纯化BV。采用奈氏试剂法检测接种重组病毒的Bm N细胞内表达融合ASP的酶活力为1 788.4U/mg;Western blot检测纯化后的BV中含融合ASP蛋白,然而BV中的ASP检测不出酶活性。试验结果提示,构建的杆状病毒GP64展示系统可以将ASP转到BV上,但产物的活性保持有待进一步研究。
- 孔莉吴岩刘永乌慧玲朱珊颖王文兵
- AcMNPV类芋螺毒素多肽的抗菌活性分析被引量：1
- 2012年
- 类芋螺毒素(CTX)基因存在于多种杆状病毒,编码富含半胱氨酸的多肽。从AcMNPV中克隆了ctx基因,利用AcMNPV杆粒操作系统构建了重组病毒Ac-pFastBac1-Pie1-ctx-eGFP和Ac-pFastBac1-Pie1-ctx。绿色荧光蛋白介导的亚细胞定位显示AcMNPV CTX定位于Tn细胞的细胞膜;抑菌实验表明,重组病毒Ac-pFastBac1-Pie1-ctx感染的胞外产物对金黄色葡萄球菌、微球菌、短小芽孢杆菌等临床致病菌具有显著的抗菌活性,但其作用机制尚需进一步阐明。
- 曹青吴岩刘永吴俣王文兵朱姗颖
- 关键词：ACMNPV亚细胞定位抗菌活性
