李洋洋
- 作品数：7 被引量：16H指数：3
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- 非洲猪瘟病毒无标签重组B602L抗原制备与鉴定被引量：5
- 2020年
- 为了获得无标签重组抗原用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测,本研究将B602L与类弹性蛋白多肽(ELP)基因进行融合表达,利用简单、经济的相变循环(ITC)纯化ELP-B602L融合蛋白,用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,再用ITC回收重组B602L蛋白;用抗体阳性猪血清对重组B602L进行鉴定;以重组B602L蛋白为包被抗原进行ELISA鉴定。结果显示重组大肠杆菌能正确表达ELP-B602L融合蛋白,纯化融合蛋白纯度大于85%;TEV蛋白酶活性包涵体切除ELP标签的效率大于90%,回收的重组B602L蛋白纯度大于90%,能与抗体阳性猪血清反应;以重组B602L蛋白为包被抗原建立的ELISA与抗体阳性血清反应为阳性,与抗体阴性血清反应为阴性,OD450值与血清稀释倍数具有线性相关性。
- 张晓凯徐保娟崔晓霞李洋洋周晓慧张鑫宇张泉夏晓莉孙怀昌
- 关键词：非洲猪瘟病毒
- 奶牛乳房炎链球菌的刃天青微量板快速诊断与药敏试验被引量：2
- 2016年
- 本研究以刃天青钠取代链球菌选择培养基EN的溴甲酚紫指示剂,建立了奶牛乳房炎链球菌快速诊断与药敏试验用微量板。将不含指示剂EN的培养基分装到96孔板,接种不同细菌或其感染模拟奶样,培养2h加入优化浓度的刃天青指示剂,结果表明能显示无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌生长,不能显示大肠杆菌和葡萄球菌生长;检测三种奶牛乳房炎链球菌总敏感性达105cfu/m L,能在10h内获得诊断结果。60份临床奶样诊断结果显示,刃天青微量板法检测链球菌阴性奶样特异性达100%,检测链球菌单阳性奶样敏感性为100%,检测链球菌混合阳性奶样敏感性达97.1%。用矫正浓度的10种抗生素包被微量板,分别用10株链球菌纯培养、感染模拟奶样和9份链球菌阳性奶样进行刃天青微量板法快速药敏试验,所获结果与标准纸片扩散法完全一致。试验结果表明,本研究建立的刃天青微量板法可取代标准方法用于奶牛乳房炎链球菌的快速诊断及药敏试验。
- 李洋洋李光亚包利平史蕾王娟孙怀昌
- 关键词：奶牛乳房炎链球菌快速药敏试验
- 非洲猪瘟病毒无标签重组K205R抗原制备与应用被引量：7
- 2019年
- 为建立敏感、特异的非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测方法,将ASFV K205R基因与类弹性蛋白多肽(ELP)进行融合表达,用相变循环纯化ELP-K205R融合蛋白,用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,用相变循环回收K205R蛋白,用抗体阳性血清对重组K205R蛋白进行ELISA鉴定。结果表明:重组大肠埃希菌能正确表达ELP-K205R融合蛋白,相变循环纯化的融合蛋白纯度大于80%;TEV蛋白酶活性包涵体能有效切割ELP标签,回收的重组K205R蛋白纯度大于95%,能被特异抗体阳性血清识别;重组K205R抗原与抗体阴性猪血清反应阴性,与抗体阳性猪血清反应阳性,D450nm值与血清稀释倍数具有线性相关性。用重组K205R抗原对已知猪血清进行ELISA检测,结果显示24份ASFV抗体阳性血清为检测阳性,24份ASFV抗体阴性血清为检测阴性,检测符合率为100%。这一研究提示制备的无标签重组K205R抗原可用于ASFV抗体检测。
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- 关键词：非洲猪瘟病毒抗体检测
- 奶牛乳腺炎葡萄球菌刃天青微量板快速诊断方法的建立与应用被引量：2
- 2015年
- 将葡萄球菌选择培养基mBP分装96孔微量板,接种细菌纯培养、感染模拟奶样或乳腺炎阳性奶样,培养2h加入0.4g/L刃天青指示剂,继续培养至12h,根据培养基颜色变化判断细菌是否生长。细菌纯培养结果显示,此刃天青微量板能显示金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、木糖葡萄球菌、产色葡萄球菌、模仿葡萄球菌和溶血葡萄球菌生长,不能显示链球菌等非葡萄球菌生长,培养基变色时间与细菌浓度和培养时间呈正相关。模拟奶样的培养结果显示,刃天青微量板检测奶样葡萄球菌的灵敏度为1×103 CFU/mL,能在12h内获得明确的诊断结果,且能反映奶牛乳腺的葡萄球菌感染强度。乳腺炎阳性奶样的培养结果显示,刃天青微量板诊断葡萄球菌阳性奶样的符合率为98.3%(n=60),诊断葡萄球菌阴性奶样的符合率为95.0%(n=40)。这些研究结果表明,本研究建立的刃天青微量板能取代常规方法用于奶样葡萄球菌的快速诊断。
- 史蕾卢会鹏李洋洋徐佳刘晓娟张鑫宇夏晓莉孙怀昌
- 关键词：奶牛乳腺炎葡萄球菌
- 盘尾丝虫ASP1蛋白佐剂活性区不同标签融合表达与佐剂活性比较被引量：1
- 2019年
- 为了探明纯化标签对盘尾丝虫活化相关分泌蛋白1(activation-associated secreted protein 1,ASP1)佐剂活性的影响,将其佐剂活性区PR-1编码序列分别与类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptide,ELP)、ELK16自聚肽或His标签进行融合表达,用相变循环、离心洗涤和镍亲和层析进行融合蛋白纯化;将ELP与传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2基因片段进行融合表达,用蛋白酶切除ELP标签后与不同标签融合PR-1免疫小鼠,两次免疫后不同时间采血分离血清,采用ELISA检测VP2特异IgG、IgG1和IgG2c滴度,用试剂盒检测免疫小鼠血清的IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10浓度。结果显示,ELP-PR1、ELK-PR1、His-PR1和ELP-VP2融合蛋白在重组大肠杆菌中均获得正确表达,纯化蛋白纯度大于90%;3种标签融合PR-1均能增强免疫小鼠的抗原特异IgG、IgG1和IgG2应答,并能刺激小鼠产生IFN-γ、TNF-α、IL-6或IL-10细胞因子。在3种PR-1融合蛋白中,ELP-PR1的佐剂活性最强,ELK-PR1与不完全弗氏佐剂相当。本研究探索了不同纯化标签对PR-1免疫佐剂活性的影响,为传染性法氏囊病新型亚单位疫苗佐剂研制提供思路。
- 胡威卢会鹏张晓凯李洋洋张鑫宇夏晓莉孙怀昌
- 关键词：融合标签佐剂
- 奶牛乳房炎大肠杆菌刃天青微量板快速诊断及药敏试验被引量：4
- 2016年
- 为了建立奶牛乳房炎大肠杆菌快速诊断与药敏试验方法,用刃天青钠取代大肠杆菌选择培养基MQQ中的酚红指示剂,通过对刃天青的工作浓度、大肠杆菌接种量和培养时间等参数的研究,建立了奶牛乳房炎大肠杆菌刃天青微量板快速诊断方法。将不同细菌及其感染模拟奶样进行刃天青微量板快速培养结果显示,此刃天青微量板对大肠杆菌具有很强的选择培养特性,能在10h内获得明确诊断结果,并能反映奶牛乳腺大肠杆菌感染强度。对89份临床奶样进行大肠杆菌刃天青微量板快速诊断敏感性和特异性检测,结果显示,此刃天青微量板法诊断大肠杆菌阳性奶样敏感性高达100%,诊断大肠杆菌阴性奶样特异性高达94.9%,总符合率高达95.5%。在此基础上用矫正浓度10种抗生素包被微量板,分别用10株大肠杆菌纯培养菌株及其感染模拟奶样和10份大肠杆菌阳性奶样进行快速药敏试验,所获结果与标准纸片扩散法完全一致。这些研究结果表明,本研究建立的刃天青微量板法可以取代常规方法用于奶样大肠杆菌的快速诊断及药敏试验。
- 王娟李洋洋徐光宇史蕾孙怀昌
- 关键词：奶牛乳房炎大肠杆菌药敏试验
- 3种TLR配体对猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗佐剂活性的比较
- 2020年
- 为比较3种TLR配体对猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP)疫苗的佐剂活性,本研究利用重组大肠杆菌表达脑膜炎奈瑟菌Ag473脂蛋白、创伤弧菌FlaB鞭毛蛋白和结核分枝杆菌热应激蛋白70(Hsp70),采用镍亲和柱纯化获得该3种重组蛋白;分别将相同剂量(10μg)3种重组蛋白、ISA206佐剂(100μL)和不完全弗氏佐剂(FIA)(100μL)与PCV2 VLP疫苗(50μg)混合,肌肉注射免疫小鼠,初免后14 d加强免疫1次;初免后每周采血分离血清,采用ELISA检测抗原特异抗体;加强免疫后14 d利用PCV2攻毒,攻毒后7 d和14 d采血分离血清,采用荧光定量PCR检测病毒DNA拷贝数;攻毒后14 d迫杀小鼠,制备并培养其脾细胞,经PCV2 VLP疫苗刺激后,采用试剂盒检测细胞因子的表达。SDS-PAGE分析结果显示,3种TLR配体在重组大肠杆菌中均获得正确表达,纯化重组蛋白的纯度大于90%。从初免14 d起,3个分子佐剂组中Ag473佐剂组的PCV2抗体水平最高,但低于ISA206佐剂组却高于FIA组,差异不显著(p>0.05)。在PCV2攻毒前,3个分子佐剂组中Ag473佐剂组的小鼠脾细胞TNF-α和IFN-γ表达水平最高,但低于ISA206佐剂组却高于FIA组,差异显著(p<0.05);Hsp70佐剂组的IL-4表达水平最高,Ag473佐剂组次之,但均高于ISA206和FIA组。在攻毒后第7 d,5个免疫组小鼠的病毒拷贝数均较对照组显著下降(p<0.05),但免疫组间差异不显著;在攻毒后第14 d,5个免疫组小鼠的病毒拷贝数进一步下降,免疫组间差异不显著。研究结果表明在测试的3种分子佐剂中,Ag473脂蛋白具有较强的总体免疫佐剂活性,有望进一步开发为PCV2等病毒的亚单位疫苗佐剂。
- 李洋洋宗扬程健王亚杰张鑫宇夏晓莉孙怀昌
- 关键词：猪圆环病毒2型分子佐剂活性比较
