孙怀昌
- 作品数：180 被引量：768H指数：13
- 供职机构：扬州大学兽医学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金江苏高校优势学科建设工程项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 犬CTLA-4胞外区的分子克隆、表达和对犬细小病毒VP2的免疫佐剂作用被引量：5
- 2008年
- 【目的】探索犬细胞毒性T细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)胞外区作为免疫佐剂的可行性。【方法】根据已发表序列设计引物,用RT-PCR扩增CTLA-4胞外区编码序列,用PCR扩增犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2蛋白主要抗原表位基因片段VP2S,将VP2S克隆入含和不含CTLA-4胞外区基因片段的原核表达质粒pQE-31;用获得的重组质粒pQE-CTLA-4-VP2S和pQE-VP2S转化大肠杆菌,并进行诱导表达;用相同剂量的重组蛋白VP2S和CTLA-4-VP2S免疫小鼠,用间接ELISA和血凝抑制试验比较两个免疫组的抗体水平。【结果】经过30次循环PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳显示预期大小的扩增产物;序列测定结果显示,克隆的毕格犬CTLA-4胞外区与已发表序列的核苷酸同源性为99.2%,氨基酸序列同源性为98.4%,结合B7分子的六肽基序(MYPPPY)无变化;VP2S与已发表CPV VP2的核苷酸序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为98.6%;经IPTG诱导后,两种重组大肠杆菌表达预期的29kDa VP2S和42kDa CTLA-4-VP2S重组蛋白,两者均能被CPV抗血清识别;间接ELISA和血凝抑制试验结果显示,CTLA-4-VP2S免疫组的抗体产生时间为初免后第2周,抗体高峰期为初免后第4周,而VP2S免疫组的抗体产生时间为初免后第4周,抗体高峰期为初免后第5周,两个试验组高峰期ELISA抗体效价和血凝抑制抗体效价分别相差100倍和10倍。【结论】犬CTLA-4胞外区可作为分子佐剂促进CPV VP2蛋白抗体的产生。
- 吴植孙怀昌张鑫宇
- 鸡输卵管特异表达载体的优化及体内表达被引量：2
- 2008年
- 为了实现鸡输卵管特异表达载体在相应组织特异高产表达,并简化质粒DNA的制备过程,本研究在已经构建的鸡输卵管特异表达载体pOV1基础上进行了优化改造,为进一步进行重组药物蛋白的暂态表达及转基因鸡研究奠定基础。首先用限制性内切酶将克隆在pOV1载体的鸡卵清蛋白基因5′-和3′-调控区切出,同时克隆到切除neo基因及CMV启动子的pcDNA3.0载体,构建成另一输卵管特异表达载体pOV2;将鸡卵清蛋白基因5′-调控区单独克隆入同样载体,获得第三个鸡输卵管特异表达载体pOV3。为了检验三个输卵管表达载体驱动外源基因在鸡体内输卵管细胞中表达的有效性和特异性,将LacZ报告基因分别克隆入pOV1、pOV2、pOV3中5′-调控区的下游,获得的重组载体pOV1LacZ、pOV2LacZ和pOV3LacZ经聚乙烯亚胺包裹后,经翅静脉注射产蛋鸡。用RT-PCR和酶活性检测法对LacZ基因在载体注射鸡体内的表达进行检测,结果显示肝、脾、肾、心等组织中无LacZ基因的表达,而输卵管膨大部不仅有LacZ基因的表达,而且表达的重组酶能分泌到蛋清中,雌激素注射对报告基因的表达具有促进作用,其中pOV3LacZ的表达水平较高。这些试验结果表明,鸡输卵管特异表达载体pOV3具有结构相对简单、表达水平较高、组织特异性较好等优点,能用于鸡输卵管生物反应器的研制。
- 高波孙怀昌王永娟房浩霞宋成义
- 关键词：LACZ基因
- 乳酸菌复壮、鉴定及其优良菌株筛选被引量：4
- 2013年
- 以某单位保存的3份乳酸菌菌种进行分离纯化,根据菌落及细菌形态分离得到7株乳酸菌,分别命名为IV-1、IV-2、IV-3、ZK、G、ST和393。利用生化试验将393株初步鉴定为乳球菌,IV-1和IV-3株鉴定为乳杆菌,IV-2、ZK、G和ST株鉴定为链球菌。再用PCR扩增16SrDNA序列,将测得的序列进行同源性分析,结果显示IV-1株为嗜酸乳杆菌,IV-3株为保加利亚乳杆菌,393株为乳酸乳球菌,IV-2、ZK、G和ST株为嗜热链球菌。选择不同乳酸菌的代表菌株进行酸乳发酵试验,结果表明不仅不同种乳酸菌的凝乳时间、产酸速度、酸乳风味和质地等存在差异,而且同种不同株嗜热链球菌也存在显著差异;在所试的6株乳酸菌中,G和ST株嗜热链球菌的综合发酵性能指标较好,其他菌株具有一定的单方面优势。结果提示,基于16SrDNA序列的遗传进化树分析可用于乳酸菌的准确鉴定,但不能取代常规方法用于优良酸乳发酵性能菌株的筛选。
- 华鹤良张军杨仁琴郭睿孙怀昌顾瑞霞印伯星田银芳
- 关键词：乳酸菌发酵特性
- 动物用质粒DNA内毒素去除方法的建立及其质量检验被引量：9
- 2009年
- 用自行改进设计的TritonX-114方法去除动物用重组质粒DNA中的内毒素,鲎试剂检测方法确定每毫克质粒DNA中内毒素的含量为50 EU。将3种不同方法制备的重组质粒pEGFPN1包裹后转染COS-7、MDCK和Marc145细胞,结果表明,经TritonX-114去除内毒素后的质粒DNA(A)与无热源质粒提取试剂盒制备的质粒DNA(B)的转染效率相当,比未经内毒素去除的质粒DNA(C)的转染效率高。将上述3种方法制备的pcDNAlacZ经PEI包裹后尾静脉注射小鼠,注射后每隔2 d扑杀小鼠,取其心、肝、脾、肺和肾组织,定量检测β-半乳糖苷酶的表达和持续时间,结果显示报告基因仅在小鼠的心、脾和肝组织中表达至第8天,A与B的表达水平接近,且明显高于C制备的pcDNALacZ的表达水平,提示经TritonX-114去除内毒素后的质粒DNA可提高转染效率和表达水平。多种动物体内注射重组质粒后,无体温升高等异常临床表征,进一步说明了使用经TritonX-114去除内毒素的质粒DNA具备良好的安全性。
- 张泉袁燕袁维峰孙怀昌朱鸿飞
- 关键词：内毒素转染效率安全性
- 可控细胞膜孔形成蛋白基因的克隆与表达
- 2004年
- 根据Wood 4 6株金黄色葡萄球菌α溶血素 (α HL)基因序列设计了引物 ,用高保真PCR从 180 0株金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出了 0 .9kb的α HL基因 ,序列测定结果显示 ,两菌株α HL基因的核苷酸序列有 6个碱基差异 ,但仅引起 1个氨基酸替换。用PCR分段克隆和定点突变技术将大肠埃希氏菌外膜蛋白A信号肽序列与α HL编码区融合 ,并将其第 130～ 134位氨基酸替换为 5个连续的组氨酸 ,获得的融合基因命名为H5基因。将其克隆入 pET 30a质粒 ,用获得的重组质粒pET H5转化感受态大肠埃希氏菌 ,获得分泌性表达H5的重组菌。经IPTG诱导后 ,重组菌表达出分子质量为 35ku的H5蛋白。经镍柱亲和层析纯化的H5对兔红细胞的半数溶血值为 180ng/mL ,能使鼠成纤维细胞PA317获得对台盼蓝和海藻糖的通透性 ,且能被Zn2 + 抑制。提示 ,表达的H5蛋白为可控细胞膜孔形成蛋白 。
- 施伟庆陈芹孙怀昌
- 关键词：金黄色葡萄球菌突变原核表达
- 重组大肠杆菌碱裂解方法的改进被引量：3
- 2007年
- 为了降低质粒DNA的生产成本,对经典碱裂解法中的溶液III进行了改进,以表达溶菌酶基因的pcDNKLYZ重组质粒转化的大肠杆菌DH5α为指示菌,用标准碱裂解和改进碱裂解法提取质粒pcDNKLYZ,以提取的质粒产量和质量为指标,判断优化碱性裂解法的性价比,结果显示,用改进后的碱裂解法裂解重组菌,提取的pcDNKLYZ质粒产量和质量等指标与标准方法接近,而成本仅为标准方法的1/4,可用于重组质粒的大规模制备。
- 张泉朱鸿飞于可响薛方明孙怀昌
- 关键词：重组大肠杆菌碱裂解法
- 生物制剂在奶牛乳房炎防治中的应用被引量：5
- 2007年
- 奶牛乳房炎是奶牛最常见、防治最难、花费最多的疾病之一,给奶牛业造成了巨大的经济损失。作者就细胞因子、溶菌酶和疫苗等生物制剂在奶牛乳房炎防治中的作用逐一进行了分析,为奶牛乳房炎的防治提供理论依据。
- 易明梅冯华朱建国华修国孟和孙怀昌袁耀明
- 关键词：奶牛乳房炎细胞因子溶菌酶
- 禽源大肠杆菌多重耐药机制初探被引量：1
- 2021年
- 为了解禽源性大肠杆菌的多重耐药机制,对禽临床样品分离株进行了药敏试验、多重耐药调控基因soxS基因及氟喹诺酮类耐药基因检测。药敏试验结果显示,从禽临床样品分离出的12株大肠杆菌中,6株对氟喹诺酮类抗菌药物耐药,11株对氨基糖苷类抗菌药物耐药,12株对四环素类抗菌药物耐药和酰胺醇类耐药。PCR检测结果显示,12株禽源大肠杆菌均携带soxS基因,表明禽源大肠杆菌多重耐药与soxS基因关系密切。序列分析结果显示,7株大肠杆菌soxS基因无突变,4株存在点突变并导致A12S替换,2株soxS突变菌株同时携带氟喹诺酮类耐药基因qnrS。因此,12株禽源大肠杆菌具有多重耐药性,可能与soxS基因调控相关,突变株的出现增强了氟喹诺酮类的耐药性。
- 杨跃飞马文杰彭时龙王鹏勇王彦红王彦红
- 关键词：禽源大肠杆菌多重耐药性分子机制
- 鸡CaBP-D28k基因克隆、序列测定及其真核表达质粒的构建
- 2008年
- 采集200日龄产蛋新扬州鸡小肠组织直接提取总RNA进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增,扩增产物进行克隆、测序,获得了新扬州鸡CaBP-D28k基因序列。序列测定表明,CaBP-D28k基因核苷酸长度为789bp,编码262个氨基酸。与GenBank上发表序列(NM_205513.1)比较,核苷酸同源性为99.9%,在760 bp处存在G→T的错义突变。与从GenBank下载的马、人、小家鼠、蟾蜍序列进行比较分析,核苷酸同源性分别为79.3%、79.1%、77.4%、77.3%。将该基因片段克隆到真核表达载体pCEP4,构建重组质粒pCEP4-CaBP-D28k,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为利用pCEP4-CaBP-D28k调控蛋禽钙代谢、改善蛋壳质量的研究应用奠定了基础。
- 俞路王雅倩章世元孙怀昌王志跃孙龙生李燕舞李治学周联高严桂芹
- 关键词：基因克隆真核表达载体
- 非洲猪瘟病毒无标签重组B602L抗原制备与鉴定被引量：4
- 2020年
- 为了获得无标签重组抗原用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测,本研究将B602L与类弹性蛋白多肽(ELP)基因进行融合表达,利用简单、经济的相变循环(ITC)纯化ELP-B602L融合蛋白,用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,再用ITC回收重组B602L蛋白;用抗体阳性猪血清对重组B602L进行鉴定;以重组B602L蛋白为包被抗原进行ELISA鉴定。结果显示重组大肠杆菌能正确表达ELP-B602L融合蛋白,纯化融合蛋白纯度大于85%;TEV蛋白酶活性包涵体切除ELP标签的效率大于90%,回收的重组B602L蛋白纯度大于90%,能与抗体阳性猪血清反应;以重组B602L蛋白为包被抗原建立的ELISA与抗体阳性血清反应为阳性,与抗体阴性血清反应为阴性,OD450值与血清稀释倍数具有线性相关性。
- 张晓凯徐保娟崔晓霞李洋洋周晓慧张鑫宇张泉夏晓莉孙怀昌
- 关键词：非洲猪瘟病毒
