丁金花
- 作品数：5 被引量：23H指数：3
- 供职机构：石河子大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 牛病毒性腹泻病毒纳米抗体文库构建与筛选被引量：3
- 2018年
- 旨在获得牛病毒性腹泻病毒(BVDV)特异性纳米抗体。通过用BVDV-E0重组蛋白对羊驼进行免疫,分离血液中的淋巴细胞。利用噬菌体展示技术,构建噬菌体展示文库,经过连续3次生物淘筛获得与BVDV-E0蛋白结合的噬菌体,对所得VHH序列进行测序和基因比对。用ELISA筛选出抗BVDV-E0的高亲和力纳米抗体,并验证纳米抗体的亲和力和活性。结果成功构建了插入率为86%、库容量为1.3×1011 cfu的噬菌体表达文库,经过筛选获得5个BVDV-E0阳性单克隆,将这些基因克隆至原核表达体系,表达和纯化后获得了高纯度的BVDV-E0纳米抗体,经亲和力的鉴定获得2个不同的高亲和力的VHH基因,并且能结合人工抗原E0,还能够被竞争抗体所阻断。研究结果为用于组装检测BVDV试剂盒和研制BVDV疫苗奠定了基础。
- 丁金花李启峰马旭升肖红冉肖盛中吴鹏盛金良陈创夫
- 关键词：噬菌体展示技术
- 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立被引量：6
- 2018年
- 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)能够引起牛羊的持续感染,临床上很难对其根除,建立该病有效检测方法对净化畜群具有重要意义。本研究构建BVDV E0蛋白基因重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达,用重组的E0蛋白为包被抗原,确定抗原最佳包被浓度为5μg/mL,最佳血清稀释比为1∶10,最佳封闭液为5%脱脂奶粉,最佳封闭条件为37℃封闭2 h,酶标二抗稀释度为1∶5000,作用时间为30 min,样品临界值X+2S为0.278。该方法与IDEXX的BVDV间接ELISA试剂盒比较总符合率为86%,与口蹄疫病毒、牛支原体、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副结核、牛布鲁氏菌病阳性血清无交叉反应。该检测方法能够用于BVDV抗体水平的临床检测,可为感染病畜的合理淘汰提供实验依据。
- 丁金花马旭升蔡卓轩肖盛中吴鹏盛金良陈创夫
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒间接ELISA
- 牛病毒性腹泻病毒BVDV-LC株的分离与鉴定被引量：10
- 2018年
- 为分离鉴定新疆地区牛病毒性腹泻病毒(BVDV)流行株,本研究通过RT-PCR检测、细胞分离培养、直接免疫荧光抗体检测、核苷酸序列测定及生物信息学分析对新疆某奶牛场采集的腹泻牛粪便样品进行了病毒分离和鉴定。结果显示,分离得到一株新的牛源BVDV,命名为BVDV-LC株。该病毒株在MDBK细胞培养时未能引起细胞病变;5'-UTR与N^(pro) PCR扩增为阳性,扩增片段与预期大小一致;直接免疫荧光检测荧光信号为阳性;病毒滴度为10^(5.6) TCID_(50)/0.1 mL;遗传进化分析显示,该分离株与猪源BVDV-SD0803株有较近的亲缘关系,同属于BVDV-1q基因亚型。本研究表明BVDV-LC株的分离鉴定对进一步开展疫苗研发、牛病毒性腹泻致病机理等方面的研究具有重要意义。
- 马旭升何延华何延华盛金良黄新丁金花豆晓霞刘贤侠
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒进化分析
- 布鲁氏菌侵染对类泛素SUMO-1表达的影响及类泛素SUMO-1慢病毒表达载体的构建被引量：1
- 2016年
- 研究布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后类泛素SUMO-1的表达变化,并构建小鼠类泛素SUMO-1基因过表达的慢病毒载体。本试验分别利用布鲁氏菌16M、M5-90侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测细胞中类泛素SUMO-1的表达;利用DNA重组技术将类泛素SUMO-1基因片段插入到慢病毒表达载体pLEX-MCS中,获得重组慢病毒质粒pLEX-SUMO-1,测序鉴定成功后转染293T细胞,包装好的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,并利用实时荧光定量PCR、Western blotting方法分别检测细胞中类泛素SUMO-1mRNA及蛋白表达水平。结果表明,布鲁氏菌16M、M5-90侵染细胞后,在感染早期类泛素SUMO-1的表达受到抑制,12h内呈现下降趋势,在12h后开始上升,极显著高于正常水平(P<0.01);测序结果证明,类泛素SUMO-1基因正确插入到pLEX-MCS质粒中;实时荧光定量PCR方法检测表明,类泛素SUMO-1mRNA转录水平上调。由此可见,布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7能够引起细胞内类泛素SUMO-1表达的改变;成功构建了类泛素SUMO-1慢病毒过表达载体,为进一步研究类泛素SUMO-1的功能奠定基础。
- 李启峰丁金花窦文静张辉陈创夫
- 关键词：布鲁氏菌慢病毒载体小鼠巨噬细胞
- 布鲁氏菌LPS及VirB2缺失株对巨噬细胞SUMO-1表达及Ubc-9转录水平的影响被引量：3
- 2018年
- 为了初步探究布鲁氏菌众多毒力因子对小鼠巨噬细胞中类泛素SUMO-1和偶联酶Ubc-9表达的影响,本研究使用经提纯的布鲁氏菌16M脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)以及布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统的VirB2缺失株侵染小鼠巨噬细胞,在不同时间段收集细胞,提取细胞总RNA和细胞总蛋白,通过qRT-PCR和Western blot技术分别检测类泛素SUMO-1的表达水平和偶联酶Ubc-9的mRNA的转录水平。结果表明,不同浓度的布鲁氏菌16M脂多糖LPS侵染小鼠巨噬细胞后,细胞中类泛素SUMO-1的表达水平和偶联酶Ubc-9的mRNA的转录水平均未发生明显变化;布鲁氏菌VirB2缺失株与阴性对照组相比,类泛素SUMO-1的表达水平和偶联酶Ubc-9的mRNA的转录水平在各侵染时间段差异具有显著统计学意义(P<0.05),可初步判定在宿主细胞中,布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统会影响类泛素SUMO-1蛋白的表达水平和Ubc-9mRNA的转录水平,从而在胞内稳定繁殖。
- 童志霞李天森李启峰丁金花张辉陈创夫
- 关键词：布鲁氏菌脂多糖SUMO-1
