刘文俊
- 作品数：6 被引量：38H指数：4
- 供职机构：扬州大学兽医学院更多>>
- 发文基金：公益性行业(农业)科研专项江苏省高校优势学科建设工程资助项目国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 非洲猪瘟病毒p72基因的纳米金探针研究被引量：13
- 2011年
- 对22株发表的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72基因序列进行比较,找出其中的高保守性区域,各设计、合成1条与保守区域互补的5′生物素标记及3′烷巯基修饰短链寡核苷酸探针,并将烷巯基修饰的探针吸附到纳米金颗粒上,制备纳米金标记探针。PCR扩增出的p72基因中的651 bp保守核酸序列,变性后与上述生物素探针及标记纳米金探针进行杂交,杂交产物加入吸附链霉亲和素的酶标板,利用亲和原理,捕获杂交产物,银染增强法对纳米金标记探针进行信号放大。结果表明:制备的纳米金探针经银染放大后,在酶标板中形成肉眼可见的黑色沉淀,可有效检测扩增出的p72基因,检测核酸浓度达到10 fmol·L-1,可用于ASFV快速诊断。
- 张鑫宇孙怀昌刘文俊夏晓莉成大荣
- 关键词：非洲猪瘟病毒
- 类弹性蛋白和Mxe内含肽介导的非洲猪瘟病毒重组蛋白K205R的表达与纯化被引量：1
- 2013年
- 为了构建Mxe内含肽(mxe intein,MI)和类弹性蛋白(elastin-like peptide,ELP)介导的重组蛋白表达与纯化系统,将PCR扩增的MI序列和限制性内切酶切取的ELP序列插入原核表达载体pET-30a,获得融合表达载体pET-MIE;将PCR扩增的非洲猪瘟病毒(ASFV)K205R基因插入pET-MIE载体,获得重组载体pET-K205R-MIE;分别将pET-MIE和pET-K205R-MIE转化大肠杆菌,对其重组蛋白表达、逆向相变循环沉淀及MI自体裂解条件进行优化。结果显示,在20℃条件下K205R-MIE融合蛋白为可溶性表达,26℃条件下逆向相变循环沉淀融合蛋白的回收率达73.2%,26℃孵育4h的裂解效率达91.4%,K205R蛋白的回收率为51.3%,纯度高达92.2%,能被ASFV免疫血清识别。结果提示,成功构建了简单、经济的重组蛋白表达与纯化系统,制备的K205R抗原可用于ASFV诊断。
- 刘文俊张鑫宇夏晓莉孙怀昌
- 关键词：非洲猪瘟病毒
- 猪CD163的分子克隆、原核表达及免疫血清制备被引量：7
- 2011年
- 采用生物信息学软件分析猪CD163结构,用RT-PCR从猪巨噬细胞RNA中扩增猪CD163前1 511 bp cDNA片段,再用PCR扩增抗原指数较高的697 bp cDNA片段,将其克隆入质粒载体进行序列测定;将cDNA片段克隆入含细胞毒性T细胞相关抗原4（CTLA-4）胞外区（IgV）编码序列的原核表达载体,用IPTG诱导重组菌表达;在变性条件下用镍亲和柱纯化融合蛋白,以每只50μg蛋白的剂量免疫小鼠3次,间接ELISA检测抗体效价;以表达CD163的猪巨噬细胞和不表达CD163的PK-15细胞膜为抗原,用Western blotting验证免疫血清的特异性,以获得猪CD163重组抗原和免疫血清,为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染机制研究提供检测试剂。结果表明：猪CD163的第45~297位氨基酸抗原指数较高,不含疏水性氨基酸集中区;RT-PCR扩增产物的大小与预期结果相符,与发表序列的核苷酸序列同源性为99.5%,氨基酸序列同源性为100%;重组大肠杆菌表达的CTLA-4 IgV-CD163s融合蛋白为预期的43 ku,主要以包涵体形式存在,通过亲和层析和尿素变性/复性获得了可溶性纯化蛋白;免疫小鼠血清的ELISA抗体效价为1∶300 000,能在CD163＋细胞中检测到预期的120 ku蛋白条带,而在CD163-细胞中未检测到相应的蛋白条带。结果提示获得的猪CD163重组抗原和免疫血清可用于PRRSV感染检测。
- 李秀媛孙怀昌宋红芹刘文俊张钰陈阳张鑫宇夏晓莉
- 关键词：分子克隆原核表达免疫血清
- 类弹性蛋白和内含肽融合表达纯化重组人防御素3被引量：3
- 2014年
- 为建立简单、经济的重组人β防御素3(HBD3)制备方法,将HBD3序列插入类弹性蛋白(ELP)与△I-CM内含肽融合表达载体,将重组载体转化大肠杆菌,20℃下用IPTG诱导融合蛋白表达,在优化条件下进行相变循环,用内含肽自裂解活性释放目的蛋白,用琼脂扩散和最小抑菌浓度法测定重组HBD3抗菌活性。结果表明:融合蛋白在重组菌中获得可溶性表达,第1轮相变循环的纯度为85.7%,再次相变循化的纯度达93.1%;内含肽裂解温度为28℃,孵育12 h裂解效率达90.3%;重组HBD3回收率达74.8%,产量为0.98 mg·L^(-1),纯度为92.6%,内毒素含量低于0.03 U·mg^(-1)(蛋白),对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有显著的抑菌活性。说明基于ELP相变循化和内含肽自裂解的重组蛋白表达与纯化系统可用于重组}tBD3的规模化制备。
- 刘文俊吴倩高慧徐碧张鑫宇夏晓莉孙怀昌
- 关键词：内含肽人Β防御素3纯化
- 嵌合蛋白P128的表达、纯化与抗牛源葡萄球菌活性研究被引量：5
- 2016年
- 将抗葡萄球菌嵌合蛋白P128编码序列优化成大肠埃希菌偏爱密码子序列,插入脑膜炎奈瑟氏菌FrpC蛋白自加工元件(SPM)与类弹性蛋白多肽(ELP)融合表达载体,将重组载体pP128-SPM-ELP转化大肠埃希菌进行诱导表达,利用ELP的温度敏感可逆相变循环(ITC)进行融合蛋白纯化,利用SPM自切割活性进行融合蛋白切割和目的蛋白回收;以牛源金黄葡萄球菌为指示菌,对回收的嵌合蛋白P128进行溶(杀)菌活性测定。结果表明:P128-SPM-ELP融合蛋白获得高水平、可溶性表达,经过两轮ITC获得的融合蛋白纯度大于90%,其自切割效率接近100%,回收的嵌合蛋白P128对金黄葡萄球菌的最小抑菌浓度为8.4μg·mL-1,且有很强的杀菌作用。证明SPM-ELP融合表达与纯化系统是简单、经济、有效的重组蛋白表达与纯化系统,获得的嵌合蛋白P128可用于葡萄球菌性奶牛疾病防治。
- 汤明元刘文俊张鑫宇夏晓莉孙怀昌
- 关键词：纯化
- 非洲猪瘟病毒E183L、B602L、K205R和A104R基因表达及诊断抗原筛选被引量：10
- 2014年
- 为了获得非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)重组蛋白pK205R、pE183L、pA104R和pB602L,将Ba71V株的K205R、E183L、A104R和B602L基因分别亚克隆进行原核表达载体pET30a(+),构建重组质粒pET-E183L、pET-B602L、pET-K205R和pET-A104R,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。IPTG诱导后,纯化表达的蛋白,并进行Western blotting鉴定,结果4种重组蛋白与预期大小一致,且与ASFV抗体发生特异性反应。为了从表达的4种重组蛋白中筛选最佳诊断抗原,将其分别包被酶标板,间接ELISA检测ASFV阳性血清,发现重组蛋白pK205R、p54和pB602L血清学反应良好;在检测ASFV感染后第13天分离血清时,重组蛋白p54和pK205R效果更佳,这表明p54和pK205R重组蛋白是较好的诊断抗原,可用于ASFV感染后早期或中后期血清学诊断。
- 张鑫宇陈宇刘文俊夏晓莉孙怀昌
- 关键词：非洲猪瘟病毒重组蛋白诊断抗原
