吴云飞
- 作品数：4 被引量：3H指数：1
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- 家蚕热休克蛋白HSP90相互作用蛋白的筛选与鉴定
- 2022年
- 【目的】HSP90 是热休克蛋白家族的成员之一,在昆虫的抗逆性和变态发育中发挥重要作用,已有研究表明 HSP90能够促进家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)的增殖,但作用机制尚不清楚。本研究通过鉴定 BmHSP90 的相互作用蛋白,为其促进 BmNPV 增殖的作用机制解析提供参考。【方法】构建连接在 pIZ/V5-His 的BmHSP90;真核过表达载体,在家蚕 BmN-SWU1 细胞中转染 48 h 后,感染 BmNPV 继续培养 48 h 后收集蛋白,保留总蛋白后将这些蛋白均分两管,进行免疫共沉淀,分别用抗 HA 抗体和 IgG 抗体钓取相互作用蛋白,对蛋白胶进行硝酸银染色后,获取差异条带并做质谱分析,将质谱结果与信息分析结合进行候选互作蛋白筛选,并克隆鉴定互作蛋白。通过免疫荧光验证 HSP90 与互作蛋白的共定位情况,并进一步采用免疫共沉淀试验确定其是否存在相互作用关系。【结果】硝酸银染色结果显示,试验组与对照组在 90、70 和 60 kD 附近处存在差异条带,并验证了 90 kD 处的差异条带为诱饵蛋白;将另外两条差异带进行质谱分析,共鉴定到 7 个候选相互作用蛋白,通过分析选择其中两个候选蛋白作后续研究,分别为Tubulin-specific chaperone E(Tbce)和 Golgin subfamily A member 5(Golga5)。BmTbce 的最大开放阅读框长度为 1 728bp,编码 576 个氨基酸,BmGolga5 的最大开放阅读框长度为 1 854 bp,编码 618 个氨基酸;同源比对和系统进化树显示 BmTbce的微管结合结构域(cytoskeleton-associated protein-glycine-rich,CAP-Gly)位于 N 端且在不同物种之间保守性较高,BmGolga5 的跨膜区(transmembrane domain,TMD)位于 C 端,也较为保守;荧光共定位显示 BmHSP90 与 BmTbce 和 BmGolga5在细胞质中发生共定位,并进一步通过免疫共沉淀证明 BmHSP90;和 BmTbce;、BmHSP90;和 BmGolga5;具有相互作用关系。【结论】经过筛选与鉴定,在 BmNPV 感染家蚕细胞的过程中,与家�
- 龙艳碧吴云飞张倩陈鹏潘敏慧
- 关键词：家蚕家蚕核型多角体病毒HSP90
- 家蚕Sox家族基因BmDichaete的克隆与表达分析
- 2017年
- 【目的】Sox家族是一类转录调控因子,在多细胞动物的发育过程中起到了极其重要的作用。本研究旨在获得家蚕Bombyx mori Sox家族基因,并分析其在幼虫不同组织和发育阶段的表达模式及功能。【方法】采用cDNA末端快速扩增方法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆家蚕Sox家族基因,并对其序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体,诱导原核表达并得到其蛋白的多克隆抗体,并以Western blot验证其蛋白在家蚕胚胎发育时期(产卵后24,48,72,96,120,144,168,192和216 h)和蚁蚕的表达特征。同时,使用半定量RT-PCR技术分析这一基因在家蚕整个发育过程以及5龄第3天幼虫不同组织(精巢、卵巢、神经节、头部、丝腺、脂肪体、马氏管、中肠、后肠、表皮、血液、气管)中的表达谱。【结果】克隆获得一个家蚕Sox家族基因,将其命名为BmDichaete(Gen Bank登录号:KY914554),其cDNA序列全长为1 541 bp,开放阅读框长741 bp,编码246个氨基酸,预测分子量大小为27.3 kD,等电点为9.89。同源序列比对和系统进化分析显示,BmDichaete具有Sox家族的典型HMG结构域,并与其他鳞翅目昆虫的Dichaete蛋白具有较高的同源性。对其表达模式分析发现,BmDichaete在家蚕整个发育时期都有表达,从胚胎发育后期到蛹前期持续高表达,在蛹后期及成虫期表达量有所下降,并且该基因在家蚕5龄第3天幼虫的卵巢、头部、丝腺及后肠组织中显著高表达。Western blot分析结果显示,BmDichaete在家蚕胚胎发育过程中持续而稳定地表达。【结论】家蚕BmDichaete具有典型HMG结构域,属于Sox家族成员。BmDichaete在家蚕胚胎发育的各个时期都发挥作用。本研究为进一步探索该基因在家蚕中的功能奠定了基础。
- 杨基贵彭丽娜刘太行吴云飞杜国玉张倩王炜潘敏慧
- 关键词：家蚕原核表达表达谱胚胎发育
- 家蚕分子伴侣BmHsp90及其辅分子伴侣BmCdc37对BmNPV增殖的影响研究
- 家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）是一种基因组为128kb左右的双链环状DNA病毒，它所引起的血液型脓病对养蚕业的危害极其严重，不仅降低了蚕丝的产量和质量...
- 吴云飞
- 关键词：家蚕多角体病毒病毒增殖蛋白质构象基因表达
- 文献传递
- 家蚕CDK11与RNPS1和9G8相互作用的鉴定被引量：2
- 2017年
- 【目的】鉴定家蚕(Bombyx mori)CDK11与RNPS1和9G8的相互作用,为解析其是否参与前体RNA的剪接打下基础。【方法】利用家蚕基因组数据库Silk DB找到本研究克隆的家蚕基因序列,采用Primer 5.0进行引物设计,通过PCR技术克隆获得家蚕的两个重要剪接因子RNPS1和9G8,并构建具有不同抗原标签的过表达载体,采用NCBI检索并获得其他物种的相关序列,利用在线预测软件SMART进行结构域预测,采用Clustal X 1.83和GENEDOC 3.2预测同源序列,利用软件MEGA 6.0构建系统进化树,通过免疫荧光验证家蚕CDK11两种剪切体CDK11A和CDK11B分别与RNPS1和9G8的共定位情况,进一步通过免疫共沉淀验证CDK11A、CDK11B分别与RNPS1和9G8的相互作用。【结果】RNPS1的开放阅读框长为882 bp,编码293个氨基酸;9G8的开放阅读框长为531 bp,编码176个氨基酸;RNPS1和9G8都属于SR蛋白家族,具有该蛋白家族成员的一个富含丝氨酸/精氨酸(S/R)重复序列的RS结构域。同源序列比对表明,RNPS1和9G8都具有典型的RRM结构域,此外9G8还含有一个锌指结构域。系统进化分析显示,RNPS1聚类于无脊椎动物一支,与同为鳞翅目昆虫的斑点木蝶、黑脉金斑蝶等亲缘关系较近;9G8也聚类于无脊椎动物一支,与同为鳞翅目昆虫的黑脉金斑蝶、金凤蝶等关系较近。荧光共定位证明,RNPS1分别与CDK11A和CDK11B共定位于细胞核中,且具有点状共聚集现象;同时发现,RNPS1还具有胞质定位,点状聚集于核外周。而9G8分别与CDK11A、CDK11B在细胞核中也具有共定位现象。进一步通过免疫共沉淀发现,在所有的总蛋白和细胞裂解离心后的上清液样品中,均能检测到对应目的条带的表达,表明共转染的细胞均能正常表达目的蛋白,并且蛋白溶于上清。同时,在所有的共沉淀条带中,均能检测到对应目的条带,以上结果表明CDK11A、CDK11B均与RNPS1和9G8具有相互作用。【结论】家蚕RNPS1和9G8具有典型的
- 张倩刘太行董小龙吴云飞杨基贵周亮潘彩霞潘敏慧
- 关键词：家蚕
