王珊
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
- 供职机构：天津医科大学基础医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- Nfic基因3′UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与miR-20a靶向关系的验证被引量：3
- 2016年
- 目的构建核因子C(nuclear factor I-C,Nfic)基因3′非编码区(3′UTR)荧光素酶报告质粒,利用双荧光素酶报告基因验证micro RNA-20a(miR-20a)与其潜在靶基因Nfic的靶向关系。方法通过micro RNA靶基因预测软件Targetscan获取miR-20a与Nfic基因3′UTR潜在的互补结合位点;PCR扩增出Nfic基因3′UTR序列,将此序列克隆至荧光素酶报告载体p MIR-Report Luciferase;将重组荧光素酶报告质粒与miR-20a mimics(实验组)或NCmimics(对照组)共同转染293-AD细胞,收集细胞后通过双荧光素酶报告系统检测2组细胞的荧光素酶活性,从而对Nfic与miR-20a的靶向调节关系进行鉴定。将miR-20a mimics和NC mimics分别转染骨髓基质细胞系ST2,裂解细胞提取蛋白后采用Western blotting检测NFIC蛋白的表达水平。结果构建的重组荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确。双荧光素酶报告基因检测显示,与对照组相比,miR-20a可以抑制Nfic 3′UTR报告基因载体的荧光素酶活性(P<0.05);Western blotting结果显示,与对照组相比,ST2细胞转染miR-20a mimics后NFIC蛋白表达水平明显下调。结论成功构建了Nfic基因3′UTR荧光素酶报告质粒,而miR-20a可以直接作用于Nfic基因3′UTR,抑制其荧光素酶活性。
- 王珊李晓霞周杰王宝利
- 关键词：微RNAS骨髓基质细胞系荧光素酶报告基因
- miR-196b海绵吸附慢病毒载体的构建及其在骨髓基质细胞系ST2中的表达
- 2017年
- 目的构建miR-196b海绵吸附慢病毒载体,为研究miR-196b在骨髓基质细胞系中的功能奠定基础。方法根据miR-196b的成熟体序列设计与之互补的串联的六重复序列设计成引物,通过PCR反应将该六重复序列亚克隆至pUC19质粒中,再经酶切连接至pLVX-shRNA2慢病毒载体,利用293T细胞将构建成功的miR-196b海绵吸附慢病毒载体进行病毒包装和滴度测定,pLVX-shRNA2慢病毒作为对照组,miR-196b海绵吸附慢病毒作为实验组,将其感染ST2细胞,观察感染效率,并通过Western blotting检测miR-196b靶基因叉头框蛋白O1(FoxO1)的蛋白水平。结果酶切鉴定和测序结果正确,慢病毒包装所测滴度为1×108PFU/mL,将其感染靶细胞,其感染效率达80%。Western blotting结果显示,与对照组相比,其靶基因FoxO1蛋白表达水平有明显增加(P<0.05)。结论成功构建了miR-196b海绵吸附慢病毒载体,并能有效吸附内源性的miR-196b,从而发挥其抑制作用。
- 杨威利王珊王宝利李晓霞
- 关键词：微RNAS慢病毒感染骨髓基质细胞
