胡小许
- 作品数：4 被引量：8H指数：2
- 供职机构：华南农业大学食品学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金中国疾病预防控制中心青年科研基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 一种定量测定副溶血弧菌溶血活性的方法
- 2013年
- 目的建立定量评价副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)溶血活性的实验方法。方法以大耳白兔红细胞为靶细胞,野生型VP标准株RIMD2210633(J5421)、opaR敲除株、toxR敲除株的菌体细胞为效应细胞,通过调节感染菌量及孵育时间来优化条件,从而建立溶血活性评价模型。结果与结论 VP最佳溶血活性条件为红细胞终浓度5%条件下,用约3×106CFU的菌量感染靶细胞,37℃孵育2.5 h。opaR负调控VP的溶血活性,而ToxR正调控VP的溶血活性。本研究成功建立了定量测定VP溶血活性的方法。
- 姜汉雯王开功张义全黄倩胡小许杨瑞馥周冬生
- 关键词：副溶血弧菌溶血活性
- AphA蛋白促进副溶血弧菌c-di-GMP合成和生物膜形成被引量：4
- 2014年
- 【目的】综合运用表型和分子生化实验研究AphA蛋白对副溶血弧菌生物膜形成的调节机制。【方法】利用菌落褶皱和结晶紫染色实验比较aphA突变株(ΔaphA)和野生株(WT)的表型差异;进而利用色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)的方法分别检测ΔaphA和WT中c-di-GMP分子含量;提取ΔaphA和WT的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法研究AphA对scrABC和scrG的调控关系;分别构建克隆有scrABC和scrG上游启动子区的LacZ重组质粒,并将重组质粒转入ΔaphA和WT中,通过测定并比较两株菌中β-半乳糖苷酶活性差异来进一步研究AphA对scrABC和scrG的调控关系;PCR扩增scrABC和scrG的整个启动子区DNA序列,并纯化His-AphA蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)验证AphA对靶基因启动子区是否具有直接的相互作用。【结果】表型结果显示AphA能促进c-di-GMP的合成和生物膜形成;实时定量RT-PCR和LacZ结果表明AphA能抑制scrABC和scrG的转录表达;EMSA结果证明AphA不能结合到scrABC和scrG的启动子区DNA上。【结论】AphA间接抑制scrABC和scrG的表达是其促进副溶血弧菌c-di-GMP合成及生物膜形成的机制之一。
- 黄倩张义全胡小许王丽杨瑞馥钟青萍周冬生黎晓敏
- 关键词：副溶血弧菌生物膜形成
- 副溶血弧菌ToxR截短体蛋白的表达纯化及其DNA结合活性被引量：2
- 2014年
- 【目的】利用大肠杆菌BL21λDE3表达系统,表达出有活性的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)ToxR截短体蛋白,为进一步研究ToxR的转录调控机制奠定基础。【方法】以VP基因组DNA为模板,PCR扩增ToxR蛋白DNA结合结构域(ToxR-N)的DNA片段,并将其直接克隆入pET28a中,获得重组质粒;将重组质粒导入大肠杆菌BL21λDE3中,所得菌株经IPTG诱导后能表达出His-ToxR-N蛋白。利用限制级凝血酶切除His-ToxR-N中的His-标签,进而以VP的calR和VP1687为靶基因,通过体外的凝胶阻滞实验(EMSA)验证ToxR-N蛋白的DNA结合活性。分别构建克隆有calR和VP1687上游启动子区的LacZ重组质粒,并将重组质粒转入野生株(WT)和toxR突变株(ΔtoxR)中,通过测定β-半乳糖苷酶活性来比较两株重组菌中靶基因启动子活性,以验证ToxR对calR和VP1687的调控关系。【结果】成功表达出有活性的ToxR-N蛋白,该蛋白对calR启动子区具有结合活性。LacZ结果显示ToxR对calR的转录具有激活作用,而对VP1687的转录具有抑制作用。【结论】所表达的ToxR-N可用于后续的转录调控机制研究;ToxR通过直接激活calR的转录表达,而间接抑制T3SS1相关基因的表达。
- 胡小许张义全黄倩王丽杨瑞馥黎晓敏周冬生钟青萍
- 关键词：副溶血弧菌DNA结合活性转录调控
- 利用优化的5′-RACE实验定位副溶血弧菌基因的转录起始位点被引量：2
- 2014年
- 目的:优化5′-cDNA末端快速扩增(5′-RACE)实验平台,用于定位副溶血弧菌(VP)基因的转录起始位点。方法:提取VP的总RNA,用rDNaseⅠ消化去除可能污染的基因组DNA;利用T4 RNA连接酶将已知序列的寡核苷酸片段连接至RNA的5′端,进而将其逆转录成cDNA;以cDNA为模板,采用巢式PCR技术扩增目的基因DNA片段,并将其直接克隆入T载体;最后通过测序比对的方法确定靶基因的转录起始位点。利用引物延伸实验进一步研究VPA1027的转录起始位点,以检验5′-RACE实验结果的可靠性。结果:5′-RACE实验结果表明,VPA1027、scrG、scrA、cpsA及VPA0198的转录起始位点分别为G(-103)、G(-70)、T(-205)、C(-129)和G(-238)(翻译起始位点为+1);引物延伸结果显示,VPA1027的转录起始位点也为G(-103)。结论:优化后的5′-RACE实验可以精确定位VP基因的转录起始位点。
- 李杰张义全高鹤王丽胡小许周冬生
- 关键词：副溶血弧菌转录起始位点
